掃描電鏡的樣本處理

實驗概要

本文介紹了掃描電鏡的樣本處理，主要包括：樣品的初步處理，樣品的干燥，樣品的導電處理，細胞內部結構冷凍割斷法和鑄型技術。

實驗步驟

1. 樣品的初步處理

   1) 取材
取材的基本要求和透射電鏡樣品制備相同。但是，對掃描電鏡來說，樣品可以稍大些，面積可達8mm×8mm，厚度可達5mm。對于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組織表面。
   2) 樣品的清洗
用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面。由于樣品取自活體組織，其表面常有血液、組織液或粘液附著，這會遮蓋樣品的表面結構，影響觀察。因此，在樣品固定之前，要將這些附著物清洗干凈。清洗的方法有以下幾種：
      a．用等滲的生理鹽水或緩沖液清洗；
      b．用5%的蘇打水清洗；
      c．用超聲震蕩或酶消化的方法進行處理。例如清洗腸粘膜表面的粘液，可用下面的方法：
清洗液配方：透明質酸酶 300ug α-糜蛋白酶 10 mg生理鹽水 100 ml清洗液的pH為5.5～6。清洗的方法是將樣品浸泡在配好的清洗液中，邊浸泡邊震蕩30分鐘，最后用雙蒸水洗3次。無論用哪種清洗方法，注意在清洗時不要損傷樣品。
   3) 固定
固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同，常用戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大，固定時間應適當延長。也可用快速冷凍固定。
   4) 脫水
樣品經漂洗后用逐級增高濃度的酒精或丙酮脫水，然后進入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。掃描電鏡生物樣品制備技術大多數生物樣品都含有水分，而且比較柔軟，因此，在進行掃描電鏡觀察前，要對樣品作相應的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結構保存好，沒有變形和污染，樣品干燥并且有良好導電性能。

2. 樣品的干燥

掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進行。無論是水或脫水溶液，在高真空中都會產生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會破壞樣品的微細結構。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進行干燥。干燥的方法有以下幾種：
   1) 空氣干燥法
空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將經過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發干燥。這種方法的最大優點是簡便易行和節省時間；它的主要缺點是在干燥過程中，組織會由于脫水劑揮發時表面張力的作用而產生收縮變形。因此，該方法一般只適用于表面較為堅硬的樣品。
   2) 臨界點干燥法
臨界點干燥法是利用物質在臨界狀態時，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體完全汽化，并以氣體方式排掉，來達到完全干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細結構。此法操作較為方便，所用的時間也不算長，一般約2～3小時即可完成，所以是最為常用的干燥方法。但用此法，  需要特殊儀器設備。臨界點干燥是在臨界點干燥儀中進行的，操作步驟如下：
      a．固定、脫水：按常規方法進行。如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100%后，要用純丙酮置換15～20分鐘。
      b．轉入中間液：由純丙酮轉入中間液醋酸異戊酯中，時間約15～30分鐘。
      c．移至樣品室：將樣品從醋酸異戊酯中取出，放入樣品盒，然后移至臨界點干燥儀的樣品室內，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。
      d．用液體二氧化碳置換醋酸異戊酯：在達到臨界狀態(31℃, 72.8大氣壓)后，將溫度再升高10℃，使液體二氧化碳氣化，然后打開放氣閥門，逐漸排出氣體，樣品即完全干燥。
   3) 冷凍干燥法
冷凍干燥法是將經過冷凍的樣品置于高真空中，通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍干燥的基礎是冰從樣品中升華，即水分從固態直接轉化為氣態，不經過中間的液態，不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，從而減輕在干燥過程中對樣品的損傷。冷凍干燥法有兩種，即含水樣品直接冷凍干 燥和樣品脫水后冷凍干燥。
      a．含水樣品直接冷凍干燥法

      取材固定：按常規方法進行。

      置于冷凍保護劑中：將樣品置于冷凍保護劑中浸泡數小時。常用的冷凍保護劑為10%～20%二甲基亞砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。

      驟冷：將經過保護劑處理的樣品迅速投入用液氮預冷至(150℃的氟利昂冷凍劑中，使樣品中的水分很快凍結。

      干燥：將已凍結的樣品移到冷凍干燥器內已預冷的樣品臺上，抽真空，經幾小時或數天后，樣品即達到干燥。本方法不需要脫水，避免了有機溶劑對樣品成分的抽提作用，不會使樣品收縮，也是較早使用的方法。但是，由于花費時間長，消耗液氮多，容易產生冰晶損傷，因此未被廣泛應用。
      b．樣品脫水后冷凍干燥
樣品用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發的有機溶劑中，然后連同這些溶劑一起冷凍并在真空中升華而達到干燥。和前一種方法比較，本方法的優點是不會產生冰晶損傷，且干燥時間短。不足之處是有機溶劑對樣品成分有抽提作用，造成部分內含物丟失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發時會冷卻固化的性質將樣品干燥的方法。其操作步驟如下：

      固定、水洗：按常規方法進行。

      乙腈置換：使用50%-70%-80%-90%的乙腈水溶液置換，最后用100%乙腈代替，每步驟15～20分鐘。

      干燥：至純乙腈時，放入真空鍍膜臺抽真空，乙腈和樣品在真空中很快致冷而被凍結(凍結的溫度為(45℃)，變成冰狀固體。然后繼續抽真空，使凍結的乙腈升華，約需30分鐘，樣品即達干燥。
樣品干燥后要粘在樣品臺上。對于不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導電膠來粘固；對于要鍍膜的樣品，則可以用膠水或萬能膠來代替，微細的樣品如粉末、纖維等也可用雙面膠紙來粘貼。

3. 樣品的導電處理

生物樣品經過脫水、干燥處理后，其表面不帶電，導電性能也差。用掃描電鏡觀察時，當入射電子束打到樣品上，會在樣品表面產生電荷的積累，形成充電和放電效應，影響對圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進行導電處理，使樣品表面導電。常用的導電方法有以下幾種：
   1) 金屬鍍膜法
金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后，不僅可以防止充電、放電效應，還可以減 少電子束對樣品的損傷作用，增加二次電子的產生率，獲得良好的圖象。
      a．真空鍍膜法
真空鍍膜法是利用真空膜儀進行的。其原理是在高真空狀態下把所要噴鍍的金屬加熱，當加熱到熔點以上時，會蒸發成極細小的顆粒噴射到樣品上，在樣品表面形成一層金屬膜，使樣品導電。噴鍍用的金屬材料應選擇熔點低、化學性能穩定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產生率、膜本身沒有結構。現在一般選用金或金和碳。為了獲得細的顆粒，有用鉑或用金—鈀、鉑—鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm～20nm。真空鍍膜法所形成的膜，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻，操作較復雜并且費時，目前已經較少使用。
       b．離子濺射鍍膜法
在低真空(0.1～0.01托)狀態下，在陽極與陰極兩個電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時，電極之間會產生輝光放電。在放電的過程中，氣體分子被電離成帶正電的陽離子和帶負電的電子，并在電場的作用下，陽離子被加速跑向陰極，而電子被加速跑向陽極。如果陰極用金屬作為電極(常稱靶極)，那么在陽離子沖擊其表面時，就會將其表面的金屬粒子打出，這種現象稱為濺射。此時被濺射的金屬粒子是中性，即不受電場的作用，而靠重力作用下落。如果將樣品置于下面，被濺射的金屬粒子就會落到樣品表面，形
成一層金屬膜，用這種方法給樣品表面鍍膜，稱為離子濺射鍍膜法。
和真空鍍膜法比較，離子濺射鍍膜法具有以下優點：(1)由于從陰極上飛濺出來的金屬粒子的方向是不一致的，因而金屬粒子能夠進入到樣品表面的縫隙和凹陷處，使樣品表面均勻地鍍上一層金屬膜，對于表面凹凸不平的樣品，也能形成很好的金屬膜，且顆粒較細。(2)受輻射熱影響較小，對樣品的損傷小。(3)消耗金屬少。(4)所需真空度低，節省時間。
    2) 組織導電法
用金屬鍍膜法使樣品表面導電，需要特殊的設備，操作比較復雜，同時對樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人采用組織導電法(又稱導電染色法)，即利用某些金屬溶液對生物樣品中的蛋白質?脂類和醣類等成分的結合作用，使樣品表面離子化或產生導電性能好的金屬鹽類化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導電率。
此法的基本處理過程是將經過固定、清洗的樣品，用特殊的試劑處理后即可觀察。由于不經過金屬鍍膜，所以不僅能節省時間，而且可以提高分辨率，還具有堅韌組織，加強固定效果的作用。
組織導電法主要有碘化鉀導電染色法、碘化鉀--醋酸鉛導電法、丹寧酸—鋨酸導電法等。比較常用的是丹寧酸—鋨酸導電法，其具體操作方法如下：
      a．樣品處理：按常規方法取材、清洗及用戊二醛固定。
      b．導電染色：將樣品放入2%～4%丹寧酸溶液中浸泡。如果觀察表面結構，浸泡時間為30分鐘；如果觀察內部結構，浸泡時間為8小時，即可過夜。在浸泡過程中，可更換一次溶液。
      c．清洗及再固定：用磷酸緩沖液充分清洗，然后放入1%鋨酸中固定2～4小時，再用磷酸緩沖液清洗。
      d．脫水和干燥：按常規方法。
      e．掃描電鏡觀察。

4. 細胞內部結構冷凍割斷法

該方法簡便，結構清晰，已得到廣泛應用。其操作方法如下：
   1) 取材和固定：為了使細胞結構清晰，不被過多的血細胞污染，可在取材前用灌注法沖洗。即先將動物麻醉，經腹主動脈注入生理鹽水或低分子量的右,切開下腔靜脈放血，至無血色為止。然后迅速取材，將樣品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%鋨酸溶液中固定1小時，用1/15M磷酸緩沖液(pH7.4)清洗兩次，每次10分鐘。
   2) 二甲基亞砜浸泡：將樣品依次放入25%、50%二甲基亞砜溶液中，各浸泡30分鐘。
   3) 割斷：用TF—1型冷凍割斷裝置進行割斷。然后將割斷后的樣品放到50%二甲基亞砜中，等融化后再用1/15M磷酸緩沖液浸洗，每次10分鐘，換液5次。
   4) 軟化及后固定：將樣品放入0.1%鋨酸中軟化，溫度20℃，時間48～72小時。然后用1%鋨酸固定1小時，雙蒸水浸洗1小時，換液幾次，需徹底清洗干凈。
   5) 導電染色：將樣品放入2%丹寧酸中2小時(或過夜)，以雙蒸水清洗1小時，換液幾次。雙蒸水清洗1小時。
   6) 脫水、干燥及鍍膜：按常規方法進行。

5. 鑄型技術

為了研究空腔臟器特別是血管系統復雜的立體分布，先向腔內注射某種成形物質，待該物硬化后再把組織腐蝕去掉，剩下的成形物即能顯示血管系統的立體分布，這種技術稱鑄型技術。如果是研究血管系統，稱為血管鑄型。用鑄型技術制作的標本，經過鍍膜后，就可進行掃描電鏡觀察。
常用的鑄型劑有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一種樹脂，為丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被認為是比較理想的鑄型劑。下面簡單介紹用ABS制作血管鑄型標本的方法：
   1) 灌流和注入鑄型劑
首先將準備灌注的器官取下或保持自然位置，找到動脈，插入玻璃管或靜脈穿刺針，并以粗絲線結扎之，用普通流水或溫鹽水將血管中的血液沖洗干凈。然后灌注鑄型劑ABS丁酮溶液，濃度為5%～30%，注入的壓力為100mmHg。注入鑄型劑的臟器，可以放在50℃～60℃的溫水中浸泡6小時左右，這樣既能保持臟器的原形，也有助于鑄型劑的硬化。
   2) 腐蝕和清洗
將標本放入10%～20%氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液中腐蝕，也有放20%～30%鹽酸中腐蝕。時間一般為5～7天。若用稀鹽酸腐蝕，可加入5%～10%胃蛋白酶，腐蝕的效果更好。然后用流水將血管鑄型周圍被腐蝕的組織沖洗干凈，時間為24～72小時，沖洗的速度要慢。
   3) 顯微解剖和剝制鑄型
為了暴露和切取要觀察的部分，需要在解剖顯微鏡下進行。如果鑄型太硬，可將鑄型浸入酒精中，加溫至40～60℃，能使鑄型變軟，便于解剖和切取。
   4) 干燥和鍍膜
將切取的鑄型用蒸餾水洗干凈，用濾紙吸干后放37℃溫箱中30～60分鐘，最后放干燥缸中保存。鍍膜可用真空噴鍍，也可用離子鍍膜，方法同前。鍍膜后就可用掃描電鏡觀察。