技術進步為質譜血漿蛋白組學帶來了巨大飛躍

　　近日美國質譜學會年會（ASMS）上發布的最新數據表明，新的儀器和工作流程極大地提高了基于質譜的血漿蛋白組學實驗的覆蓋深度和通量。這些進步可使質譜成為各應用領域中更有用的工具，包括血漿蛋白生物標志物的開發以及迄今由Olink和SomaLogic等親和性平臺主導的大規模人群研究。

　　血漿是一種易于獲取和常用的樣本來源，尤其是在臨床工作和人群研究中。然而，由于血漿含有大量豐度較高的蛋白質和較寬的動態范圍，傳統的質譜蛋白質組學分析能力不足。對于細胞裂解物的分析，質譜工作流程可測量8000到12000個蛋白質，但對血漿，類似的工作流程只能測量500到1000個蛋白質。雖然可通過去除豐度較高的蛋白質或進行粗分離來改善這一情況，但這也會犧牲通量。

　　去年，瑞士蛋白質組學公司Biognosys在Journal of Proteome Research雜志上發表了一項研究，他們使用賽默飛的Orbitrap Exploris 480質譜儀，通過兩小時的液相色譜梯度測量了180個去除了高豐度蛋白的血漿樣品中的2732個蛋白質，這是未進行血漿分離處理情況下最高深度的血漿蛋白質組分析。

　　最近，蛋白質組學公司Seer推出了一種新的血漿蛋白組學解決方案。該公司的Proteograph系統使用一組納米顆粒來富集血漿蛋白質，然后可以使用質譜等技術對其進行鑒定和定量分析。與傳統的血漿蛋白組學方法相比，Seer系統在覆蓋深度和通量上都有所提升。在一份發表于四月BioRxiv預印本的研究中，威爾康奈爾醫學院-卡塔爾團隊使用該系統分析了345個血漿樣本，測量了大約3000種蛋白質，在其液相色譜-質譜法的運行時間下每天可分析大約10個樣本。

　　根據以上數據，Biognosys分析和Seer系統的覆蓋深度都接近于Olink的Explore平臺，后者可以在血漿中測量大約3000種蛋白質，但它們仍遠遠落后于SomaLogic的SomaScan平臺，后者可以在血漿中測量大約7000種蛋白質。在每周約70個樣本的處理量上，Biognosys和Seer系統的通量仍然落后于Olink和SomaLogic平臺，后者每周分別可以處理多達1000個和340個樣本。

　　ASMS年會上，Thermo Fisher Scientific展示了使用Seer最新發布的Proteograph XT試劑盒在其新的Orbitrap Astral儀器上測量大約6000種蛋白質的數據，每天處理大約30個血漿樣本。這些數據標志著血漿蛋白組學工作流程的重大進展，并表明在大規模血漿研究方面，結合Seer Proteograph等血漿富集技術的質譜法與基于親和性的平臺現在可能成為競爭對手。

　　劍橋大學臨床醫學院MRC流行病學單位的生物信息學家Maik Pietzner表示：“坦白說，我們沒有預見到這么大的飛躍。”他和他的同事在大規模蛋白質基因組學研究中使用了SomaLogic的SomaScan和Olink的Explore。他指出，根據ASMS展示的數據，“看起來現在似乎變得可行了”，因為他們的研究需要1000個或更大的樣本隊列。

　　華盛頓大學基因科學教授Michael MacCoss還表示，質譜技術具備的覆蓋深度和通量使其成為大規模人群研究的有用工具。他說：“像英國生物庫（UK Biobank）或弗雷明漢心臟研究（Framingham Heart Study）這樣的大型隊列……這些樣本的價值是巨大的，研究人員希望能夠以最少的資源獲取最多的信息，很多實驗都使用了Olink或SomaLogic。”

　　如果質譜技術能夠可靠地提供ASMS演示中展示的覆蓋深度和通量，它可能成為親和性平臺的有力補充和競爭對手。許多蛋白質存在多種形式，或稱為蛋白質變體，其變異包括氨基酸變異、截斷或翻譯后修飾等，這些變化會影響它們的功能，在親和性平臺上往往不清楚或不確定測量的是蛋白質的哪種變體。質譜方法更適合分析這些不同的蛋白質變體。

　　Olink總裁Carl Raimond表示，他認為質譜和親和性平臺是“絕對互補的”，并補充說“看到蛋白質分析領域有創新是非常好的”。然而，他表示在Olink占據領先地位的大規模人群研究中質譜技術近期可能無法成為競爭對手，他同時也質疑ASMS展示的令人印象深刻的數據在廣泛應用時是否能夠經受考驗。他說：“細節決定成敗。提出要求很容易，但真正能夠實現或提出關于這一要求背后的問題則是完全不同的事情。”Raimond補充說，雖然質譜技術不斷改進，但親和性平臺也將不斷進步。Olink正在將其Explore平臺擴展到約5,000種蛋白質靶點，而SomaLogic計劃在今年年底前將SomaScan平臺擴展到覆蓋約10,000種蛋白質。Pietzner同樣表示，雖然在ASMS上發布的數據令人興奮，但他和他的同事們期待看到更廣泛的數據，包括總體的蛋白質覆蓋范圍，不同蛋白質和肽段在樣本中檢出的一致性和重復性。他說，“親和性方法已經應用于規模大于50,000的人群隊列中，并帶來了驚人的發現。我們需要進行頭對頭的比較以評估這些新的質譜技術是否能夠實現類似的擴展。”

　　MacCoss表示，使用質譜進行此類研究的公司或研究人員需要提供數據，證明他們能夠在每個樣本中一致且可重復地測量一組核心蛋白。他說：“當人們使用Olink時會有一個清單，上面列出了每次都會測到的蛋白質。我們仍然需要這樣做。我們仍然需要說，這是每次實驗都會返回定量值的蛋白質列表……以及測量中獲得高質量分析數值的蛋白。”

　　Pietzner表示，他和他的同事目前正在努力擴展他們的蛋白質基因組學研究以包括質譜技術。強生和強生制藥公司的神經科學數據科學主管，以及英國生物庫藥物蛋白質組學項目（PPP）主席Christopher Whelan表示，目前一個規模最大的蛋白質基因組學人群研究項目正在實施基于質譜的蛋白質組學。

　　Seer本月宣布推出Seer技術訪問中心，該中心將組合其XT試劑盒與Orbitrap Astral質譜儀，為沒有質譜儀的用戶提供蛋白質組學服務。

　　盡管到目前為止很難全面評估Thermo Fisher的Orbitrap Astral和Seer的Proteograph XT的性能，但一些早期用戶表示其產生的結果很出色。

　　Cedars-Sinai精準生物標志物實驗室主任Jennifer Van Eyk一直在使用Orbitrap Astral進行血漿蛋白質分析，在這方面它比先前的儀器有更強的能力。Van Eyk表示，在每天運行60個樣本時，新儀器可測得的蛋白質數量是相同工作流程下使用Thermo Fisher的Exploris 480儀器的2到2.5倍。

　　她說：“我們不僅可以檢測到更多蛋白質，而且可以定量更多蛋白質，并且這些蛋白質是可重復的，也就是說，如果我們運行一個樣本五次，我們確實會五次都觀察到同樣的蛋白。這是一個很大的飛躍。”這臺儀器最出色的或許是其高通量，Van Eyk表示，她和她的同事們每天可以運行多達180個的未去除高豐度蛋白的血漿樣本并獲得良好的數據和深度的覆蓋。她說，“在每天運行180個樣本的情況下，突然間你可以開始討論運行10,000個樣本，然后它就成為一個人群研究了。”Van Eyk和她的同事目前正在試驗Seer Proteograph系統，以“充分測試”其性能，并評估是否要將其作為血漿蛋白質組學工作流程的一部分。

　　威斯康星大學麥迪遜分校的生物分子化學和化學教授Joshua Coon指出，他的實驗室能夠使用50分鐘的液相色譜梯度在未處理的血漿中測量大約1,500種蛋白質，并且已經在該儀器上開發出了一種一分鐘的直接注射方法，能夠在每個樣本中測量約200種蛋白質。

　　Coon還是SeerProteograph平臺的用戶，盡管他尚未將其與Orbitrap Astral結合使用。他的實驗室一直在使用Seer XT試劑盒分析阿爾茨海默病患者的血漿樣本以及長期新冠肺炎（long COVID）個體的樣本。他說，盡管他的團隊尚未開始處理大批量樣本，但在初步工作中，實驗室每個樣本一致地測量到約3,000種蛋白質，這是不使用Seer系統時的五倍左右。他認為，當研究人員將工作流程應用于Orbitrap Astral系統時，這些數字還會進一步提高。

　　除了覆蓋深度外，Coon表示，Proteograph對簡化質譜樣品制備非常有用。他說：“我沒有完全認識到到它的自動化程度，它非常方便。現在主要的用戶是一個一年級和二年級的研究生……所以他們必須快速學習。他們在處理樣本、獲得消化產物和肽段方面取得了很大的成功。當你有新人或者長時間不做該工作的人時，進行大規模蛋白質組學研究的樣品制備將耗費整個實驗一半以上的精力，只需使用該平臺然后熟練掌握。”

　　盡管Seer Proteograph平臺提供的覆蓋深度使質譜血漿蛋白質組學在某些應用中與Olink和SomaLogic等親和力平臺更具競爭力，但Seer本身在血漿富集領域面臨新的競爭。

　　在ASMS會議上，蛋白質組學樣品制備公司PreOmics推出了其ENRICH-ist富集血漿和血清蛋白質的試劑盒。該試劑盒使用非功能化順磁性微珠來富集低豐度蛋白質，據該公司稱，與未去除高豐度以及未富集的血漿相比，用該試劑盒處理血漿可將蛋白質檢出率從50%提升至100%。PreOmics首席執行官Garwin Pichler表示，微珠與緩沖液的結合可在去除高豐度蛋白的同時富集低豐度蛋白以提高覆蓋深度。Biognosys推出了一種新的基于微珠的血漿蛋白質組富集試劑盒，作為其TrueDiscovery服務平臺的一部分。據該公司稱，這種試劑盒可以高通量定量人類血漿中約4,000種蛋白質。

　　此外，在本月，華盛頓大學研究人員領導的團隊在BioRxiv預印本上發表了一篇論文，描述了一種使用ReSyn Biosciences的磁性微粒富集血漿蛋白質的方法，其通過結合血漿中的膜結合囊泡并分析相關蛋白質來提高覆蓋深度。華大的MacCoss是這篇預印本的通訊作者，該預印本的第一作者Christine Wu也是該富集方法的主要開發者。他們能夠在Orbitrap Astral上使用30分鐘的液相色譜梯度穩定地定量約4,800種血漿蛋白質，每天可處理約40個樣本。在使用一小時的液相色譜梯度時，他們能夠測量5,000到6,000種蛋白質。MacCoss他們迄今沒有過度挑戰該方法的能力，所以這些數字是相對保守的。MacCoss表示，由于Seer公司的技術成本較高，研究人員對于血漿蛋白質組學富集的替代方法很感興趣。他說：“Seer在制造這些產品方面做得很好，但成本是一個高門檻。”

　　維也納分子病理研究所的蛋白質組學負責人Karl Mechtler表示，他與Seer的討論中，每個樣品的報價大約是600美元。他說：“如果我有100個樣品，對于一個蛋白質組學實驗室來說，這是一筆巨款。”他指出，對于一個典型的蛋白質組學實驗室，一個合適的價格范圍應該在每個樣品25到50美元左右。Wu表示，使用華大的富集方法進行實驗的每個樣品成本低于5美元。PreOmics將ENRICH-ist試劑盒作為完整蛋白質組學樣品準備工作流程的一部分銷售，每個樣品總共80美元。

　　在回答成本問題時，Seer公司董事長兼首席執行官Omid Farokhzad表示，他認為價格是“價值交換的問題”。他說：“并非所有內容都是等價的。問題在于，從Seer所提供的與其替代方案所提供的內容來說，價值交換是什么？”在血漿蛋白質組學領域最新的發展中，這個問題的答案似乎是一個不斷變化的目標。

　　參考文獻：

　　[1] Tognetti Marco,Sklodowski Kamil,Müller Sebastian et al. Biomarker Candidates for Tumors Identified from Deep-Profiled Plasma Stem Predominantly from the Low Abundant Area.[J] .J Proteome Res, 2022, 21: 1718-1735.

　　[2] bioRxiv  -Genomics Pub Date : 2023-04-21 , DOI：10.1101/2023.04.20.537640Karsten Suhre, Guhan Ram Venkataraman, Harendra Guturu, Anna Halama, Nisha Stephan,Gaurav Thareja, Hina Sarwath, Khatereh Motamedchaboki, Margaret Donovan, Asim Siddiqui, Serafim Batzoglou, Frank Schmidt