在《抗體偶聯技術從哪里創新？》一文中，曾提及過東南大學與南京東納生物公司聯合開發了一種簡單的親和偶聯與化學偶聯結合的方法，實現抗體定向包被在聚苯乙烯微球表面。近日，東南大學再度發表文章，揭示了一種更為簡單的抗體定向偶聯方法和機制。
在免疫學實驗中，我們常常需要將抗體包被在固相表面，如96微孔板，膠體金顆粒，聚苯乙烯微球，或者磁性顆粒表面。傳統的標記方法如物理吸附、共價偶聯等是隨機的將抗體偶聯在固相表面。這種隨機性容易導至抗體不定向的固定在固相表面，如Fab端朝下，倒立吸附；橫躺在固相表面；Fc端朝下，立在固相表面。最后一種是抗體偶聯最為理想的形式，可以充分保護抗原結合位點活性，減少空間位阻影響。
△抗體在固相表面的四種形式。來源：Biointerphases, 2017, 12(2): 02D301
東南大學新論文發表
揭示抗體抗體定向偶聯方法與機制
近日，東南大學研究者再度與東納生物在國際期刊Langmuir發表文章，揭示了通過調節pH，改善EDC/sulfo-NHS交聯方法，實現抗體在羧基表面聚苯乙烯微球上的定向偶聯。
研究者發現在抗體的Fab端，堿性氨基酸的數量要多于酸性氨基酸，意味著Fab端擁有更多的氨基；而在抗體的Fc端，兩種氨基酸的數量分布更均勻，因此，Fab端的等電點要略高于Fc端的等電點。
因此，在不同的pH環境下，雖然抗體整體電荷為正或者為負，但是Fab端與Fc端的帶電量可能會存在差異。通過亨德森 - 哈塞爾巴赫方程，從pH環境從4.8增加到8.8過程中，Fab端與Fc端電荷變化量是不一致的。從圖2中曲線可以看到，當pH小于6.8時，Fab端與Fc端同時帶正電荷，但是Fab端帶電量要高于Fc端。當pH大于6.8，此時Fab端依然帶正電，而Fc端開始帶負電。因此，在抗體偶聯或者標記過程中，不同的pH會導至抗體的電荷分布不一致，而影響抗體的偶聯效果。
△抗體Fab端與Fc端隨pH變化曲線。來源：Lou D, Ji L, Fan L, et al. Langmuir, 2019,35(14): 4860-4867
研究者通過在不同的pH條件下，采用EDC/NHS兩步偶聯方式，將鼠IgG1抗體偶聯在羧基表面聚苯乙烯微球（PS）上。
研究發現，當處于pH7.8環境下，抗體Fab端帶正電荷，此時Fc端帶負電荷。而此時PS微球表面由于大量的羧基處于去質子化狀態，帶負電。因此抗體的Fab端將因為靜電吸附作用優先與PS微球結合。另一方面，在pH7.8時，Fab端的終端氨基要比側鏈賴氨酸上的氨基更容易去質子化（-NH3+脫去一個質子，形成NH2），去質子化的氨基更容易與活化的羧基反應。因此，在這種條件下，是不利于抗體Fc端與PS微球表面羧基結合，而導至抗體Fab朝下，即處于Head-on狀態，失去與抗原結合的能力。
而當處于pH5.8的環境下，Fab端與Fc端都帶正電，因此都有可能通過靜電吸附，附著在PS微球表面。并且此時，Fab端的氨基也處于質子化狀態（NH3+），反應優先級被降低。另外，Fc端雖然帶正電荷，但是其帶電量要明顯低于Fab端，其水化層更薄，疏水性更強，更易于參與反應。最后，兩步法反應中，第二步抗體偶聯反應pH降低，NHS酯水解速度更慢，氨基-羧基的反應速度也較慢，為抗體在羧基表面調整方向提供了時間。
研究者通過抗Fc端抗體捕獲包被在PS微球表面的Fc端含量，證實了這一理論。
△抗體表面偶聯機制。圖片來源Lou D, Ji L, Fan L, et al. Langmuir, 2019,35(14): 4860-4867
小結
雖然這一理論和實驗看似簡單，但是卻為抗體的包被和標記提供了理論指導。我們國內大多數IVD企業都集中精力在產品研發上，而缺乏這樣的時間和資源去研究這樣簡單的技術理論，導至許多研發人員知其然而不知其所以然，無法對產品研發和生產形成理論技術指導。這大概是產品之間存在質量差距的原因之一吧。同樣，國內許多高校的基礎研究處于技術前沿，無法短時間內對行業形成應用或者影響，導至產業與學術研究脫節。因此，看似簡單的實驗和理論，確實更“接地氣”的研究。我們也希望會有更多的高校或者公司企業，能夠有這樣“接地氣”的研究，指導我們的IVD企業更好的開發產品。
參考文獻：Lou D, Ji L, Fan L, et al. Antibody-orientedstrategy and mechanism for the preparation of fluorescent nanoprobes for fastand sensitive immunodetection[J]. Langmuir, 2019, 35(14): 4860-4867.