單克隆抗體雜交瘤技術基本流程
單克隆抗體的制備步驟
1、免疫原的制備；
2、免疫動物 ；選擇體重18-20g BALB/C 雌性小鼠用于免疫。50-100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經背腹部皮下多點注射及腹腔注射相結合的方式免疫，總的免疫體積0.2-0.3ml每只；間隔3周，取與一免減半量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml每只；過2-3周后用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行融合；
3、細胞融合 ；取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在無血清的RPMI-1640培養基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養基；用50% PEG（Sigma,分子量1500－4000）作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min；用無血清的RPMI-1640培養基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養基懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的細胞板中，37℃，5% CO2的細胞培養箱中培養。雜交瘤細胞的制備過程
4、雜交瘤細胞及陽性孔的篩選；細胞培養器皿中培養5天后，用HAT培養基換液一次，第10天用HT培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底10%-50%時，用常規間接ELISA方法篩選陽性孔，獲得對上述抗原有反應的陽性孔；
5、陽性孔的特異性檢測及特異性陽性孔的克隆；陽性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法：用包被液稀釋成1-10ug/mL的抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃過夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10％的脫脂奶粉封閉30-60min;加入陽性孔培養上清100ul/孔，37℃ 1-2 小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小時，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/L H2SO4終止反應后，用酶標儀讀取OD492的值，以與陰性OD值比值大于2.1為陽性。獲對抗原有特異性反應的陽性孔。篩選出的特異性陽性孔用常規的有限稀釋法克隆，獲能分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細胞株。細胞株進一步擴大培養，用于制備單抗腹水和液氮凍存；
6、雜交瘤細胞和一般細胞的凍存及復蘇方法；雜交瘤細胞通常用含有8％-10%的二甲亞砜和30％小牛血清的培養基凍存于液氮中，在液氮中細胞可以保存多年，在-80℃中可以作3-6個月短期保存。凍存細胞需要緩慢降溫（4℃冰箱放置15-30分鐘，-20℃冰箱放置30－60分鐘，-80℃超低溫冰箱中放置24小時），然后放置液氮中長期保存；也可用細胞程序凍存盒直接放置-80℃超低溫冰箱。復蘇細胞時需快速升溫，這樣可以確保細胞有較高的存活率。凍存細胞管直接放入37℃水中快速升溫復蘇，離心后去凍存液，沉淀的細胞用培養基懸浮后細胞培養箱培養；
7、單克隆抗體腹水制備及純化；取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10×105個雜交瘤細胞，7-10天后可見小鼠腹部明顯膨大，取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。純化：取1倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時，12000rpm離心30min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時，5000rpm離心5min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃PBS流動透析24小時后即獲純化的抗體，-70℃保存；
8、單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定；將單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C 小鼠IgA、IgG1、IgG2a、
IgG2b、IgG3、IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗或雙抗夾心ELISA方法鑒定。用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，腹水效價在10-5-10-7之間的可用于實際應用；
酶聯免疫吸附試驗技術（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性實驗）
ELISA是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發展起來的一種免疫測定技術，既可以定性也可以定量。主要過程包括將已知抗原(抗體)吸附在固相載體即聚苯乙烯微量滴定板上稱為包被,然后用封閉液（5% BSA/PBS 溶液）將空余的位點占據，以避免后續抗體非特異性吸附。洗滌后加待測抗體(抗原), 再加相應酶標記抗體，形成已知抗原--待測抗體--酶標二抗的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算待測抗體(抗原)的量。
ELISA原理
（1） 抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學活性；
（2） 抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物,而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；
（3） 酶結合物與相應抗原或抗體結合后,可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在,而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗結果；
常用ELISA方法
1、直接法：檢測抗原
A:將待檢測抗原吸附在固相載體表面；
B:加酶標抗體，形成抗原-抗體-酶復合物；
C:加底物。底物的降解量＝抗原量。
2、間接法 ：檢測抗體（本次ELISA方法）
A: 將已知抗原吸附于固相載體表面；
B: 加待檢測抗體，形成抗原抗體復合物；
C: 加酶標二抗；
D: 加底物。測定底物降解量=抗體量
3、雙抗體夾心法：檢測抗原
A:將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相表面；
B:加待檢抗原，形成抗原-抗體復合物；
C:加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復合物；
D:加酶標抗抗體(第二種動物抗體的抗體)；
E:加底物。底物的降解量＝抗原量。
4 競爭法：測定抗原
A:將抗體吸附在固相載體表面；
B:對照孔只加入酶標抗原；
C:樣品孔加入酶標抗原和待測抗原，競爭結合抗體；
D:加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
