抗體的純化實驗

實驗方法原理 利用細菌胞壁蛋白的特性可以提供了一個快速、簡捷、特異、高效的抗體純化方法。這里細菌胞壁蛋白主要指蛋白 A 和蛋白 G，它們分別從金黃色化膿性葡萄球菌和 G 組鏈球菌分離純化。它們能特異結合到免疫球蛋白的 Fe 部分。由于它們對不同的免疫球蛋白有不同的親和力，所以應根據免疫球蛋白的種類和類型選擇蛋白 A 或蛋白 G。例如，純化免疫兔產生的多克隆抗體需選用蛋白 A 分離純化，而免疫羊產生的多克隆抗體則用蛋白不同種類及類型的免疫球蛋白與二者親和力不同。同理，具有蛋白 A 或蛋白 G 結合部位的嵌合蛋白也可用于抗體的分離純化。蛋白 A 或蛋白 G 與抗體的結合可以通過酸堿度、鹽濃度和溫度的改變解離。蛋白 A 或蛋白 G 在實驗室就能有效地偶聯到介質上。

實驗材料 抗體溶液

試劑、試劑盒 蛋白 A- 或 G-瓊脂糖Tris-HCl NaCl

儀器、耗材 親和柱

實驗步驟

1. 建議從商業提供的蛋白 A- 或 G-瓊脂糖開始。如從蛋白 A 或 G 偶聯到介質開始，則偶聯到溴化氰活化的瓊脂糖的方法前面；

2. 蛋白 A- 或 G-瓊脂在起始緩沖液（100 mmol/L，pH 7.5 Tris-HCl，100 mmol/L NaCl） 內室溫放置 30 min。每 g 介質約用 10 ml 緩沖液。水合作用期間干介質體積將溶脹 3～4 倍，此后步驟如不注明均在室溫下進行；

3. 溶脹后的介質在起始緩沖液內裝柱。再用 5～10 倍體枳同樣緩沖液洗柱，建議最大流速為 1 ml/min；

4. 3～5 倍體積 0.1 mol/L，pH 2.5 glycine-HCl 洗柱。洗去可能存在的污染物；

5. 再用 5～10 倍體積起始緩沖液平衡柱。若欲存放則應用含 0.02％ NaN3 的起始緩沖液平衡，然后 4℃ 保存；制備抗體溶液

6. 抗體樣品液離心 10 000×g，10 min，除去沉淀；

7. 用等體積起始緩沖液稀釋樣品，或加入 1/10 體積 10× 起始緩沖液，以獲得適當的 pH 和離子強度；

8. 上樣，即將緩沖好的樣品液加到親和柱內。每 ml 溶脹介質可以上樣 2 ml 多克隆抗體血清或 20 ml 單克隆抗體上清。通常上樣的總 IgG 量應略低于柱總結合容量的 80％，每 ml 溶脹介質能結合 5～20 mg IgG；

9. 在洗脫前，用 10 倍體積起姶緩沖液洗柱。讓 A280 值恢復到基線或本底水平；

10. 用 5～10 倍體積 0.1 mol/L glycine-HCl（pH 2.5） 緩沖液洗脫結合的抗體。洗脫液以 1 ml 為洗脫組分分部收集，收集試管含 0.1 ml 1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）緩沖液以便及時中和低 pH；

11. 匯集 A280 大于等于 0.2 的峰組分；

12. 若需除去鹽分或改變緩沖液，可以在磷酸緩沖鹽液（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KC1，6.5 mmol/L Na2HPO4）中透析，或過凝膠離心柱，或用超濾的方法；

13. 以 1 ml 為單位分裝，近期用的存放 4℃， 長期儲存放 -20℃；

14. 親和柱用 5 倍體積 0.1 mol/L glycine-HCl（pH2.5）洗脫液再次洗后，用 10 倍體積起始緩沖液平衡，即可再次使用。如欲存放，用含 0.02％ NaN3 的起始緩沖液平衡后 4℃ 保存。

注意事項

與蛋白 A 或 G 結合的抗體最常用低 pH 溶液洗脫。應該注意在酸性條件下抗體不太穩定，較好的辦法是用緩沖能力強的中性溶液收集洗脫組分。使目的抗體洗脫后很快進入中性環境，以免失活。