抗體純化工藝開發平臺策略親和層析篇

　　介紹

　　在抗體藥物純化工藝中，通常采用經典的三步或兩步層析法，蛋白A（Protein A）親和介質（填料）因其配基上有多個區域對抗體Fc片段具有特異性吸附能力，因此廣泛用于抗體捕獲步驟（第一步層析）。通過一步親和工藝，可去除細胞培養澄清液中大部分的雜質，純度可達95％以上。然而，蛋白A親和層析填料較昂貴，可占抗體藥物下游純化工藝中層析填料成本的80％以上。因此，親和層析工藝的選擇不僅需要關注產品質量，還要從成本角度考慮到最終產品的市場競爭力。

　　隨著純化技術的發展，Protein A層析填料在不斷的改進，目前用于抗體捕獲的重組Protein A可以與瓊脂糖微球等填料基質進行多點偶聯，進而減少了使用過程中配基脫落的現象，影響層析結果。此外，為滿足生物制藥工藝清潔及消毒的要求，Protein A層析填料一般可以耐受0.1-0.5M氫氧化鈉的處理。需要注意的是，不同廠家的Protein A親和層析填料在耐堿性、結構序列、填料基質偶聯方式、結合載量以及配基脫落率等方面存在較大差異，因此在選擇Protein A親和層析填料時一定要系統考量，通過科學的實驗對淋洗條件、洗脫方式和保留時間等步驟進行詳細的工藝開發，在保證產品質量的同時，盡可能降低相關成本。親和層析原理見圖1。

圖1. 親和層析原理圖

　　親和層析

　　親和層析工藝主要由5個部分組成：

　　1. 平衡：用平衡液對層析填料進行平衡，達到最佳結合狀態；

　　2. 上樣：讓目的蛋白充分的與填料接觸，達到良好的吸附效果；

　　3. 淋洗：用淋洗液沖洗掉非特異性結合的雜質；

　　4. 洗脫：將結合的目的蛋白從層析填料上洗脫，達到分離純化的效果；

　　5. 清洗：對使用完的層析填料進行再生及消毒。

　　常規抗體親和層析工藝流程見圖2。

圖2. 親和層析工藝步驟

　　在親和層析工藝開發階段，平衡步驟已經趨于平臺化，各公司均有平臺緩沖液及相關的方法可以達到良好的平衡效果，在清洗步驟上，可以根據廠家推薦的清洗方式進行填料的再生及消毒，基本不需要進行相關的工藝開發工作。但是在上樣、淋洗及洗脫階段，由于不同蛋白在不同的填料上層析表現及產品質量會有較大的差異，因此需要進行詳盡的載量測試實驗、淋洗工藝的優化及洗脫工藝的優化實驗，以獲得最終的親和層析工藝，開發策略見表1。

　　表1. 抗體類藥物親和層析工藝開發平臺策略

　　動態結合載量（DBC）測試

　　Protein A親和層析為結合-洗脫模式，蛋白分子在層析柱里的保留時間對結合載量具有顯著的影響。推薦考察6 min保留時間條件下，填料對目的分子的結合能力。在上樣過程中，取不同點的流穿液檢測Titer，并繪制流穿曲線，以確定填料的動態結合載量，然后以動態結合載量的80%作為安全限度，確定最終的載量范圍，推薦實驗方案如表2：

　　表2. 親和層析填料DBC測試實驗方案

　　圖3. 親和層析DBC測試目的蛋白流穿圖（舉例）

　　親和層析淋洗條件優化

　　親和層析上樣結束后，在洗脫之前一般會加入淋洗步驟，目的是去除非特異性結合的雜質如HCP和HCD等。經典的沖洗方式為高鹽溶液淋洗（0.5-1.0M NaCl）及弱酸性溶液淋洗(pH5.0-6.0)。在工藝開發過程中，可以考慮組合不同的淋洗方式，考察其對雜質的去除效果，對沖洗條件進行篩選，推薦實驗方案如表3。實驗完成后，親和層析收集樣品檢測SEC純度、HCP及HCD殘留，計算收率，選擇最佳的淋洗工藝。特別提醒，淋洗工藝的選擇可能會對整個親和層析步驟在病毒去除的效果上產生較大影響，同時，也可能會對填料的使用壽命具有一定影響，因此淋洗工藝的開發不可忽視。

　　表3. 親和層析淋洗條件優化實驗方案

　　親和層析洗脫條件優化

　　Protein A和抗體Fc段的結合主要以His殘基之間的靜電作用為主，因此，Protein A親和層析通常采用降低緩沖液pH的方式進行洗脫，當洗脫pH降低至4.5以下時，His殘基帶正電荷，抗體上His殘基與Protein A上的His殘基產生靜電排斥作用，抗體從Protein A上解離。有研究表明，洗脫階段不同的緩沖液類型會對產品質量和層析收率有明顯影響，因此親和層析洗脫階段的優化，通常需要先對緩沖體系進行篩選，推薦實驗方案見表4。

　　表4. 親和層析洗脫緩沖液篩選實驗方案

　　除緩沖體系外，針對不同的親和填料，不同的洗脫pH也會影響蛋白與Protein A的解離效果，對工藝的收率產生影響，并且對收集產品中的雜質（聚體、片段等）和殘留（HCP、HCD和Protein A等）水平也有較大影響。因此，需要對洗脫pH進行研究，樣品檢測SEC純度、 nrCE純度及殘留，并計算收率，篩選出符合預期的洗脫條件，推薦實驗方案見表5。

　　表5. 親和層析洗脫pH優化實驗方案

　　親和填料清洗條件優化

　　Protein A層析填料通常可以使用高濃度的離液劑進行再生，比如6M尿素和6M鹽酸胍等，但是由于這些試劑使用成本較高，一般不推薦使用。在早期的工藝開發階段可以使用廠商推薦的方案進行填料的清洗和再生。目前比較常見的方法為弱酸/氫氧化鈉的組合進行清洗，比如1M醋酸加0.1-0.5M氫氧化鈉。針對不同的親和填料，由于Protein A本身的耐堿性能差異較大，因此氫氧化鈉的濃度需要謹慎選擇。如果項目進行至晚期研究階段，在進行填料壽命研究之前，建議對填料的清洗方法進行詳細的開發，以便最大限度的延長使用壽命。

　　病毒去除

　　Protein A親和層析除了對HCP和HCD等雜質具有良好的去除效果，同時對一些病毒的去除也有不錯的效果，如對異嗜鼠白血病病毒（X-MuLV）的去除率（LRV）通常在1.0-3.5范圍內，對鼠細小病毒（MVM）的去除率（LRV）在0.0–3.0范圍內。具體的LRV值與親和層析本身的工藝條件息息相關，這可能是由于病毒與填料的非特異性結合或病毒與被捕獲的蛋白分子之間的非特異性結合所導致。因此，Protein A親和層析工藝在開發過程中需要適當考慮對病毒的去除效果并進行優化，比如可以在淋洗緩沖液中加入去污劑，高鹽溶液等。

表6. ProteinA親和層析病毒去除研究結果（舉例）

　　總結

　　本文著重介紹了親和層析工藝開發過程中需要重點關注的部分工藝參數，除此之外，在實際執行親和層析工藝開發時，如柱高、紫外峰收集范圍等工藝參數也需要綜合考慮，只是此類參數在開發過程中可依據公司平臺制定，通常無需專門設計實驗進行研究。另外需要注意的是，在親和層析的淋洗及洗脫開發階段，如果按照上述常規方法開發時出現淋洗效果不佳、洗脫過程中出現拖尾現象或洗脫收集樣品聚體含量較高等情況，則可以考慮在相應的緩沖液中加入一些金屬鹽、氨基酸或去污劑等添加劑進行實驗，常用的添加劑包括氯化鈣、氯化鎂、精氨酸和吐溫20等。

　　參考文獻

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