抗體純化方法介紹

抗體制備

制備出效價高，特異性強，穩定性好的抗體是免疫學實驗取得成功的基礎，抗體質量的好壞直接影響著研究者研究的成敗，不同的免疫學實驗方法（如ELISA，IHC，IP，ICC,SDS-PAGE, WB等）對抗體的效價，濃度和純度有不同的要求。我們知道，一般免疫血清中含有特異性抗體和非特異性抗體，血清蛋白以及其他各種雜蛋白等，在制備特異性抗體過程中當抗體的效價達到實驗預期之后，我們所制備的抗體的純度關鍵取決于所選擇的純化方法。下面就一一介紹常用抗體純化方法及其相關原理。

1.鹽析法（飽和硫酸銨沉淀法）
該純化方法是基于在待純化免疫血清中加入飽和硫酸銨溶液，由于抗體也是一種蛋白質，其在水溶液中的溶解度是由其本身攜帶的親水基團數和電荷數決定的，當我們向抗血清中加入飽和硫酸銨溶液后，硫酸根離子和銨根離子與抗體競爭溶液中的水分子，因為硫酸根離子和銨根離子與抗體分子相比，具有更強的親水性，因此抗體分子表面的水化膜被破壞，同時其暴露出來的帶電基團被溶液中的鹽離子所中和進而導致其溶解度大大降低，依據此原理從而將其從抗血清中分離。

具體實驗步驟如下：
將5ml抗血清與0.01M PBS在離心管內等體積混合，向其中加入10ml飽和硫酸銨溶液，邊滴加邊搖勻，然后置于2到8攝氏度靜置過夜。
將步驟a中的待分離物于離心機內離心，8000r/min離心15到20分鐘，除上清。
將步驟b中離心后的沉淀用2ml 0.01M PBS 溶解，然后緩慢加入3ml 飽和硫酸銨溶液，邊滴加邊搖勻，然后置于2到8攝氏度靜置2小時。
將步驟c中的待分離物于離心機內離心，8000r/min離心15到20分鐘，除上清。
將步驟d中離心后的沉淀用1.65ml 0.01M PBS 溶解，然后緩慢加入3.35ml 飽和硫酸銨溶液，邊滴加邊搖勻，然后置于2到8攝氏度靜置2小時。
將步驟e中的待分離物于離心機內離心，8000r/min離心15到20分鐘，除上清。
將步驟f中離心后的沉淀用1ml 0.01M PBS 溶解, 轉移到MD 14000透析袋內，用0.01 M PBS進行透析，透析4次以上，每次至少1小時以上。

2.正辛酸-飽和硫酸銨沉淀法
該純化方法原理是：正辛酸在偏酸條件下，能與抗血清中或者小鼠腹水中的雜蛋白結合，在等電點附近將其沉淀，IgG類抗體則存在于上清液中，再利用飽和硫酸銨沉淀法即可進一步提純。

具體實驗步驟如下：
將抗血清或者小鼠腹水于離心機中離心15到20分鐘，8000r/min，以去除其中的細胞碎片或者其他沉淀物等雜質。
將1體積的抗血清或者腹水與2體積的0.06M PH 4.8的醋酸鹽緩沖液進行混合，室溫下，邊攪拌邊緩慢加入正辛酸，加入正辛酸的量為33ul/ml抗血清或者腹水。
室溫混合15到30min
2到8攝氏度靜置過夜，使其充分沉淀。
 8000r/min離心15到20分鐘，棄去沉淀取上清。
將上清轉移到MD 14000透析袋內，用0.01 M PBS進行透析，透析4次以上，每次至少1小時以上。
利用鹽析法（飽和硫酸銨沉淀法）對步驟f中透析后的上清進行純化，具體實驗見上，此處不再贅述。

3.Protein A和protein G純化法
基本原理：protein A和proteiin G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結合。Protein A和protein G 作為配基可以被偶聯到瓊脂糖凝膠上，當抗血清從中流過時，特異性的IgG就與配基結合，其他雜蛋白則穿流而過。因兩種蛋白純化抗體時對不同宿主的抗體的結合能力不同，我們需要具體情況具體對待，分別選擇protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G組合。一般推薦小鼠單抗IgG2a,IgG2b,IgG3，兔，人，豬的多克隆抗體用protein A純化，而小鼠單抗IgG1, 大鼠單抗，小鼠，大鼠，山羊的多克隆抗體則選擇用protein G純化。

具體實驗步驟如下：
稱取經CNBr活化了的sepharose 4B 0.5g, 溶于2mM的HCL溶液中，4攝氏度過夜，使其充分溶脹。
將溶脹好了的sepharose 4B預裝于層析柱中，用10倍體積的2mM HCL溶液洗滌三次后用0.1 M NaHCO3 溶液對柱子進行平衡
將5mg protein A/G 溶于0.1 M NaHCO3溶液中，加入步驟b中已平衡好的柱子，置于搖床上輕輕混合2到8攝氏度過夜或者室溫2到4小時
用0.1 M NaHCO3 溶液洗滌c中已經結合了蛋白的柱子三次。事先留取已經結合過了的上清，用紫外可見分光光度計測定結合后上清中蛋白的濃度，以確定結合率。
用0.01M tris base 平衡柱子三次，加入0.5% BSA封閉sepharose 4B上未結合的位點，置于搖床上在室溫反應2到4小時。
用0.01M tris base 平衡柱子3次。
加入要純化的經預處理了的抗血清5ml，置于搖床上在室溫反應2到4小時.
用0.01M tris base 洗滌柱子三次以上，洗掉未結合的雜蛋白
用9ml 0.1 M PH 2.5甘氨酸洗脫結合在柱子上的抗體
將1ml 1M NaHCO3溶液加入EP管中中和步驟i中洗脫的抗體
將步驟j中的抗體溶液裝入透析袋經PEG20000或者蔗糖濃縮至2ml后于0.01M PBS中透析4次以上，每次換液間隔時間為1小時以上。
將透析好了的抗體用紫外可見分光光度計測定其在波長280nm處的吸光值，用吸光值除以1.35即為所測抗體的濃度
將所純化的抗體加入30%-50%的甘油置于-20攝氏度或者-80攝氏度即可長期保存。

4.免疫親和純化法
基本原理：將抗原作為一種配基偶聯在sepharose 4B上，血清等生物液體中的特異性抗體與sepharose 4B上的抗原進行特異性結合，其他雜蛋白和雜抗體則不被結合，通過洗滌和洗脫等一系列實驗步驟即可得到高純度的目標抗體。本方法雖然和Protein A/G均被稱為親和純化方法，但是純化得到的最終的抗體還是有很大區別的，Protein A/G純化得到的主要是非特異性的IgG類抗體，而本方法純化得到的主要是特異性的IgG類抗體，與其他純化方法相比，本方法純化得到的抗體其特異性最強，純度最高。本純化方法的實驗步驟與protein A/G純化方法基本一致，將實驗方法三的配基protein A/G換成相應的目標抗原即可。

隨著生物下游加工技術的不斷發展，各種生物大分子特別是抗體大分子的分離純化方法也越來越多，比如分子篩層析(凝膠層析或凝膠過濾)，離子交換層析等等也在實驗中被用到。以上介紹的只是一般IgG類抗體的純化方法，其他IgM,IgA，IgD,IgE等抗體的純化方法要依據各自性質的不同選擇符合其自身特點的純化方法。