實驗概要
本實驗介紹了擬南芥原生質體制備轉化操作流程。
主要試劑
1. 纖維素酶解液：
試劑 | 15ml酶液體系 | |
1 | 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) | 0.225g干粉 |
2 | 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) | 0.045g干粉 |
3 | 0.4M mannitol | 1.09g干粉 |
4 | 20mM KCl | 1 ml 0.3 M KCl母液 |
5 | 20mM MES,pH5.7 | 1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 |
6 | 加入10ml 水 | |
7 | 55℃水浴加熱10分鐘，冷卻至室溫后加入以下試劑 | |
8 | 10mM CaCl | 1 ml 0.15M CaCl2 |
9 | 0.1﹪ BSA | 1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存） |
10 | 5 mM β-Mercaptoethanol | 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液 |
11 | 用0.45μm濾膜過濾后使用 | 過濾 |
2. PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好現用現配，每個樣品需100μl PEG4000溶液，可根據實驗樣品量調整溶液配置總量）
PEG4000 | 1g |
水 | 0.75ml |
0.8 Mannitol | 0.625ml |
1 M CaCl2 | 0.25ml |
約1.2ml |
3. W5 溶液
W5（1000ml） | ||
154mM NaCl | NaCl | 9g |
125mM CaCl2 | CaCl2.H2O | 18.4g |
5mM KCl | KCl | 0.37g |
5 mM glucose | glucose | 0.9g |
0.03﹪ MES | MES | 0.3g |
pH to 5.8 with KOH，高溫高壓滅菌20分鐘，室溫保存。 |
4. MMG溶液
MaMg溶液（500ml） | ||
15mM MgCl2 | MgCl | 0.71g |
0.1﹪MES | MES | 0.5g |
0.4 M mannitol | Mannitol | 36.5g |
用KOH調pH 5.6，高溫高壓滅菌20分鐘，室溫保存。 |
5. WI溶液
WI(200ml) | ||
0.5M mannitol | mannitol | 18.217g |
4mM MES,pH5.7 | MES | 0.3g |
20mM KCl | KCl | 0.12g |
高溫高壓滅菌，室溫保存。 |
實驗步驟
1. 土培室播種種植擬南芥。
2. 生長良好情況下在未開花前用于取材葉片制備原生質體。
3. 剪取中部生長良好的葉片用刀片切成0.5 -1 mm寬的葉條。
4. 將切好葉條擲入預先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大約需10-20片葉子）。并用鑷子幫助使葉子完全浸入酶解液。
5. 用真空泵于黑暗中抽30分鐘。（此時可配制PEG4000溶液，200和1000 ul槍頭去尖使操作時吸打緩和。）
6. 在室溫中無須搖動繼續黑暗條件下酶解至少3個小時。當酶解液變綠時輕輕搖晃培養皿促使原生質體釋放出來。（此時預冷一定量W5溶液）
7. 顯微鏡下檢查溶液中的原生質體，擬南芥葉肉原生質體大小大約30-50 um。
8. 在過濾除去未溶解的葉片前用等量的W5溶液稀釋含有原生質體的酶液。
9. 先用W5溶液潤濕35-75 um的尼龍膜或60-100目篩子，然后用它過濾含有原生質體的酶解液。
10. 用30毫升的圓底離心管100g，1-2分鐘離心沉淀原生質體。盡量去除上清然后用10ml 冰上預冷的W5溶液輕柔重懸原生質體。
11. 在冰上靜至原生質體30分鐘。
以下操作在室溫23℃下進行
12. 100g離心八至十分鐘使原生質體沉淀在管底。在不碰觸原生質體沉淀的情況下盡量去除W5溶液。然后用適量MMG溶液（1m）重懸原生質體，使之最終濃度在2X105個/ml。
13. 加入10 ul DNA（10-20微克約5-10kb的質粒DNA）至2ml離心管中。
14. 加入100 ul原生質體（2x104個），輕柔混合。
15. 加入110 ul PEG溶液，輕柔拍打離心管完全混合（每次大約可以轉化6-10個樣品）。
16. 誘導轉化混合物5-15分鐘（轉化時間視實驗情況而定，要表達量更高也許需要更高轉化時間）。
17. 室溫下用400-440 ul W5溶液稀釋轉化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉化反應。
18. 室溫下用臺式離心機100g離心2分鐘然后去除上清。再加入1ml W5溶液懸浮清洗一次，100g離心兩分鐘去上清。
19. 用1ml WI溶液輕柔重懸原生質體于多孔組織培養皿中。
20. 室溫下（20-25℃）誘導原生質體18小時以上。
21. 激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP標簽表達。
（以上實驗可以根據自己實驗情況適當調整）
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