試劑、試劑盒
| 儀器、耗材 | |
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| 實驗 步驟 | 建議在短日照條件下培養材料以誘導營養生長，并在照光的早期收取材料以提高獲得完整葉綠體的產率。所以試劑應在收集材料之前準備好，并連同其他一些設備，如離心機轉頭及離心管等在冰箱或冰上冷卻至
0~4°C。為避免葉綠體過多地暴露于光下或破碎，所有操作應盡可能在綠光下迅速完成。整個分離過程 30~40 min 可以完成。 ( 1 ) 在 10 h 光照（23°C ) / 14 h 黑暗（17°C ) 光周期條件下培養擬南芥材料 5~6 周，開花前收取葉片。 ( 2 ) 配制所有溶液，并連同所有設備（包括離心機以及轉頭）一起冷卻至 0~4°C。 ( 3 ) 剪取植物葉片（見注釋 2) ，并用蒸餾水清洗以確保沒有土壤附著。 ( 4 ) 按每 10 g 材料加 100 ml 勻漿緩沖液（介質 A ) 的比例將材料和預冷的緩沖液混和在帶有利刃的攪拌機中研磨 3 次，每次 10s。 ( 5 ) 勻漿液用雙層尼龍布過濾（22 μm，見注釋 3) 。 ( 6 ) 濾液在 1300 g 離心力下離心 3 min，沉淀即為葉綠體粗提物。 ( 7 ) 將葉綠體粗提物重新懸浮在盡可能小體積的介質 B 中（輕輕攪動液體讓沉淀懸浮）。將懸浮的粗提物置于 Percoll 非連續梯度（40%~85%，見注釋 4 ) 表面，用 swing-out (非固定轉角）轉頭在 3750 g 離心力下離心 10 min。 ( 8 ) 用尖頭吸管從 40% 與 85% Percoll 的界面處收集完整的葉綠體，加入介質 B 以稀釋 Percoll，直至葉綠素濃度為 1~3 mg/ml ( 見注釋 5) 。然后在 1200 g 的離心力下離心 3 min，所得沉淀即為完整的葉綠體。 ( 9 ) 要繼續分離類囊體和基質蛋白，則加入裂解液輕輕地懸浮葉綠體沉淀，至葉綠素濃度為 1~3 mg/ml。懸浮液置于冰上 5~10 min，讓葉綠體吸水膨脹并最終破裂釋放出基質蛋白。也可以用微量研磨器對樣品輕輕地稍加勻漿以更好地破碎葉綠體，注意研磨不能用力，以免破壞類囊體。 ( 10 ) 10000 g 離心力下離心 20 min，所得上清液即為基質蛋白抽提物，沉淀即為類囊體。為更好地去除污染，上清液需要在 300000 g 的離心力下繼續離心 25 min (參見注釋 6)。 ( 11 ) 用含有 3kDa 過濾器的離心濃縮器濃縮基質蛋白。裂解液中各種鹽離子濃度均比較低，與各種樣品緩沖液（如等電聚焦緩沖液、SDS 緩沖液、藍綠或無色非變性膠緩沖液以及用于蛋白酶解的緩沖液）均能兼容。 ( 12 ) 類囊體部分重新懸浮在相同的裂解液中，并進行色素和蛋白質定量。后續的蛋白質組分析需要用有機溶劑（如 70% 丙酮）或離子（SDS) 與非離子（OGG、DM ) 變性劑去除其中所含的色素（葉綠素和胡蘿卜素）以及脂溶性分子（如質體醌）。最近的一些有關葉綠體膜蛋白組的分析可以參考文獻 [7, 8, 10, 11 ，18, 19]。 |