擬南芥轉基因植株PCs含量的測定

實驗概要

本實驗測定了轉基因擬南芥總谷胱甘肽(GSH)含量、非蛋白巰基(NPT)含量。

主要試劑

200 uM CdSO₄，5% sulfosalicylic acid(含6. 3 mM diethylenetriaminepentaacetic acid <DTPA>)，Co-enzyme working solution，Substrate working solution (DTNB)，K₂HP0₄，DTNB (10 mM)

主要設備

研缽，勻漿器，高速離心機，紫外分光光度計

實驗材料

轉基因擬南芥幼苗

實驗步驟

用200 uM CdSO₄處理盆栽25 days的轉基因擬南芥幼苗(土壤中Cd的終濃度為12.2 mg/kg soil)，3 days后，分別稱取擬南芥葉片0. 5 g，液氮研磨稱粉末狀，加入lml 5% sulfosalicylic acid(含6. 3 mM diethylenetriaminepentaacetic acid <DTPA>)。將勻漿4℃離心10 min X 12,000 g，收集上清分別用來檢測總谷胱甘肽(GSH)含量和非蛋白巰基(NPT)含量。

總谷胱甘肽(GSH)含量的測定(按“Total Glutathione Quantification Kit"<DoJinDo Molecular Technologies，Inc.>)說明書進行：

1. 順序加140 ul Co-enzyme working solution和20 ul enzyme working solution；

2. 30℃溫育5 min；

3. 加20 ul樣品液；

4. 30℃溫育10 min；

5. 加20 ul Substrate working solution (DTNB)，室溫靜置10 min；

6. 于412 nm處測定吸光值，根據標準曲線確定GSH的含量。

NPT含量的測定：

1. 取樣品液300 ul與630 ul K₂HP0₄和25 ul DTNB (10 mM)(DTNB=Ellman's reagent=5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (5,5’-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸))

2. 混合，室溫靜置2 min后；

3. 于412 nm處測定吸光值；

4. 根據以下公式計算NPT的含量：

Abs(sample)=(Tot. Vol./sample vol.) x (Abs₄₁₂)

Sample Calculation：Ave. = Abs(sample)/13600=3.7 mM thiol

其中：Tot. Vo1=955 ul，sample vol=300 ul

PCs含量的計算：

PCs含量即NPT含量與GSH含量之間的差值。