腫瘤標志物是能夠反映腫瘤存在的化學物質，其存在或量變可提示腫瘤的性質，借此了解腫瘤的組織發生、細胞分化、細胞功能，幫助腫瘤的診斷、分類、預后判斷以及治療指導。本文介紹了應用iTRAQ試劑和MALDI-TOF/TOF找尋退行性神經間質瘤生物標志物的方法。
本實驗旨在應用iTRAQ試劑和MALDI-TOF/TOF對正常腦組織和退行性神經間質瘤樣品進行蛋白質鑒定和定量比較。
實驗內容
樣品制備和iTRAQ試劑標記
4個樣品分別為正常腦組織1、正常腦組織2、化學治療非敏感腫瘤和化學治療敏感腫瘤，分別用iTRAQ試劑114、115、116和117標記。每個樣品50mg的組織粉末與1.5ml的裂解緩沖液（9.8M尿素，4%CHAPS，1mM PMSF，5μg/ml leupeptin，10mM NaF，2mM?Na3VO4，1mM?EDTA）混勻，冰上放置5min，勻漿，13000g離心5min。樣品用TCEP還原，用碘乙酰氨烷基化。樣品用胰蛋白酶消化過夜，酶解液真空干燥后再用iTRAQ溶解緩沖液（50mM碳酸氫三乙銨緩沖液，pH 8.5）溶解。然后用iTRAQ試劑114、115、116和117分別標記每個樣品的肽段混合物，室溫反應1h，再把標記好的樣品混合，并加入10倍體積的SCX上樣緩沖液。
強陽離子交換色譜
用強陽離子交換色譜分離組織蛋白酶解肽段混合物，分成11份。用0~500mM的KCl，10mM磷酸氫二鉀，25%乙腈，pH3.0作為洗脫梯度液，梯度時間20min，流速1ml/min。收集11個餾分。
反相色譜分離
每個SCX餾分用LC Packing Ultimate液相色譜系統進行反相色譜分離，用100μm×15cm PepMap C18反相柱子，梯度設置：95%A（97.9% H2O，2% ACN，0.1%TFA）12min，95%A到50% B（85%ACN，9.9%H2O，5%IPA，0.1%TFA）。流速250nl/min。洗脫液直接用Probot Micro Fraction Collector點到MALDI靶上，每個點上收集12s。用MICROTEC配件將基質（7mg/ml CHCA，75%ACN，微量檸檬酸二銨）以2倍于洗脫液的流速在靶前混進洗脫液中，最后點到靶上。
數據采集與處理
用AB SCIEX MALDI-TOF/TOF質譜儀自動采集數據，每個MALDI點采集15個母離子做二級，利用空氣為碰撞氣體，碰撞能量為1KV。ProteinPilot 4.0軟件分析數據，利用Mascot進行數據庫檢索。數據庫為Celara fasta格式數據庫。ProteinPilot 4.0軟件計算每個iTRAQ試劑的報告離子簇面積，并給出結果。
結果與討論
實驗共鑒定了4594個肽段，對應1513個蛋白質，其中大于等于3個匹配肽段的蛋白質484個，iTRAQ試劑報告離子記數大于20，雖然嚴格的標準可能過濾掉一些潛在的標志物，但保證了蛋白質鑒定的高可信度，并提供了多個肽段的進行統計定量，保證了定量的準確性。根據蛋白質表達量在4個樣品里的不同，將所鑒定的蛋白質分為4類：在兩個腫瘤樣品里都表達下調的；在正常和腫瘤樣品里表達不變的；在腫瘤樣品里表達上調的；在第2個腫瘤樣品里表達上調的。結果分析發現角質纖維酸性蛋白（GFAP）相對兩個正常腦組織樣品和另外一個腫瘤樣品在對化學治療敏感的腫瘤樣品里表達量很高。GFAP是神經角質瘤的標志物，3個不同的Annexin蛋白（A1、A5和A6）在化學治療非敏感的腫瘤中都是表達上調的。
小結
本文應用AB SCIEX MALDI-TOF/TOF和iTRAQ試劑成功地對正常腦組織和退行性神經間質瘤樣品進行了蛋白質鑒定和定量比較，共鑒定了4594個肽段，對應1513個蛋白質，其中大于等于3個匹配肽段的蛋白質484個。許多與腦功能相關的蛋白質在兩種腫瘤組織里表達都是下調的，有幾個蛋白質只在一個腫瘤樣品里表達上調，包括化學敏感腫瘤的標志物GFAP蛋白，而Annexin?A1只在化學治療非敏感的腫瘤中表達上調。