分別在一定數量的試管中加入不同濃度的標準抗原（或未知樣品），每管加入等量的放射性標記抗原和一定量的抗體，在4℃或37℃下保溫,待反應平衡后,選用適當的方法將B和F分離，測量放射性強度,由放射性強度比B/T對Ag量制出標準曲線,即可從標準曲線上查出未知樣品量。
測定時，首先要制備出純的抗原和抗體。凡能刺激機體產生抗體，且與抗體發生特異性結合反應的物質通稱為抗原，例如蛋白質(細菌、病毒、異種血清等)。只有反應原性而無免疫原性的物質稱為不完全抗原或半抗原，如多糖、類脂和一些小分子物質。可用化學方法把一些半抗原與載體（蛋白質的大分子）結合而獲得免疫原性,這種結合為RIA 開辟了廣泛的應用范圍。常用的載體有γ球蛋白、纖維蛋白質、雞卵蛋白、血藍蛋白和各種甲狀腺球蛋白。半抗原結合載體是由半抗原的功能基團與載體功能基團所決定，一般連接后不應引起半抗原結構改變，也不使載體蛋白變性。常用結合載體的方法有混合酸堿法、水溶性的羰二亞胺法等。
抗體是能與相應抗原或半抗原專一地結合的免疫球蛋白分子。應用免疫技術可以獲得特異性的抗體。抗體的敏感度范圍由其特異性和親和力決定，測定時所用的抗體稀釋度越低，則加入的量越多，測定的敏感度越低，可測范圍越寬。如加入抗體量少，則測定的敏感度提高，可測范圍變窄。一般在選定標記抗原用量后，即可根據測定要求來選擇合適的抗血清用量。
常用于標記抗原的放射性同位素有3H、125I、131I 等，3H可以置換有機化合物中的氫，且不影響原有化學性質。3H半衰期長，能量低，便于防護，常用的標記化合物有3H環磷酸鳥苷、3H環磷酸腺苷、3H睪丸酮等。125I 和131I原子的化學性質比較活潑,標記方法簡便,不論多肽、蛋白質或小分子半抗原均可進行碘標記。有些半抗原不能直接用碘標記, 常常接上一個酪氨酸再以碘標記,以減少標記抗原免疫化學活性的損失。常用的偶聯試劑有：碳化二亞胺類、異?唑鹽類、烷基氯甲酸酯類、二異氰酸鹽類及亞氨酸酯等。
