放射自顯影術

DPX

顯影液 停影浴液 定影液 硫代硫酸鈉洗液 蘇木素 磷酸緩沖液 乙醇 組織透明劑

蓋玻片

建立培養

1. 在蓋玻片、載玻片（Ninc，Bellco ) 或皮氏培養皿上建立幾份同樣的單層培養。

2. 在 37°C 條件下培養，直至細胞到達適合標記時。

加入核素

3. 通常以 0.1~10 μCi/ml (約 4.0 KBq~0.4 MBq/ml )、100 Ci/mmol ( 約 4 GBq/pmol ) 的量加入核素，適合處理 0.5~48 h。

4. 吸去全部含有核素的培養液，用 BSS 小心地清洗細胞，然后棄去培養液和洗液。

固定和處理細胞

5. 用冰冷的乙酸甲醇間定細胞 10 min。

6. 制片：

(a)蓋玻片：用 DPX 或 Permmmt 將蓋玻片封在載玻片上，細胞面向上。

(b)懸浮生長或胰蛋白酶消化后的細胞懸液：將細胞離心到玻片上或采用滴液制片。

(c)為了確定合適的曝光時間，多準備幾張對照玻片，以便后面使用。從現在起所準備的玻片統稱為 “玻片” 。

7. 當標記 DNA 、RNA 或蛋白質時，用冰冷的 0.6 mol/L TCA 提取酸溶性的前體（10 min，3 次）。同時進行對照提取，如用脂性溶劑或酶消化。

8. 用明膠溶液浸泡玻片 2 min 。

9. 垂直引流玻片上的液體后，使其晾干（這些玻片可在 4°C 條件下干燥儲存)。

建立放射自顯影

10. 將玻片移入暗室。

11. 在暗紅色安全燈下，在 46°C 水浴箱將乳膠融化。

12. 用 1 張干凈的玻片輕輕地將乳膠混勻，注意不要產生氣泡。

13. 浸泡玻片：

(a)將玻片在 46°C 乳膠中浸泡 5 s，確認細胞被完全浸沒。注意溫度是至關重要的，將決定乳膠的厚度，并隨之決定分辨率。

(b)取出玻片，引流乳膠 5 s。

(c)再將玻片用乳膠浸泡 5 s。

(d)取出玻片，垂直引流 5 s。

(e)用紙巾將每張玻片的背面揩干。

(f)將玻片平放在 1 張薄紙或濾紙片上 10 min，晾干。

(g)將玻片放在避光盒的格珊上，使其完全干燥。不要急于使玻片干燥，應在濕潤的條件下慢慢晾干，以避免使乳膠脆弱。

14. 玻片干燥約 2~3 h 后，將其移入含有干燥劑如硅凝膠的避光顯微切片盒中。保證不要觸到玻片，并保證不要使玻片彼此接觸或與干燥劑接觸。

15. 用黑色乙烯膠帶將切片盒密封，再用黑紙或聚乙烯包裹，然后將切片盒放入冷藏箱。確認這個冷藏箱不用于儲存核素。

16. 將切片盒在 4°C 條件下放置 1~2 周。所需要的確切時間取決于樣本的活性，這可通過間隔處理幾張玻片來確定。玻片曝光時間過長時，背景加深和潛在的圖像易于褪色。最好是增加標記活性而不使玻片曝光時間太長。

處理放射自顯影細胞

17. 將切片盒帶回暗室，在暗紅色安全燈下將密封帶拆開。

18. 使玻片恢復大氣溫度和濕度約 2 min。

19. 準備 20°C 顯影液（20% Phenisol （Ilford））。

20. 將玻片在顯影劑中放置 2.5 min，間隔地輕輕晃動。

21. 用超純水將玻片進行簡短沖洗。

22. 將玻片移入定影液（30 % 硫代硫酸鈉）中，定影 5 min。

23. 用去離子水浸洗后，將玻片放在硫代硫酸鈉定影劑中，定影 1 min。

24. 用冷的流水沖洗玻片，或通過 5 次換水將玻片清洗，5 min 以上。

25. 待玻片干燥后，用顯微鏡進行觀察。也可用相差顯微鏡觀察置入水中的 # 00 薄蓋玻片。當觀察完成時和在水干涸之前，將蓋玻片取出，否則蓋片將黏到乳膠上。

染色

26. 用蘇木精染色：

(a)在剛過濾的蘇木精中將玻片染 45 s。

(b)將玻片在流水中清洗 2 min。

(c)在 50%、70% 和 100% 乙醇中逐級脫水。

(d)用組織透明劑透明玻片。用 DPX 封蓋玻片。如果使用蓋玻片，必須用 #00 蓋玻片，并且用最少的封固劑，以便使 100× 物鏡有足夠的工作距離。

27. 用 Giemsa 染色：

(a)將干燥的玻片浸入純凈的 Giemsa 染液中 1 min。

(b)用 pH 6.5 的 0. 01 mol/L 磷酸緩沖液將染液以 1 : 10 原位稀釋 10 min。

(c)通過用水向上置換，除去染色液。不應將玻片取出或將染液倒掉，否則在染液頂部形成的浮渣將黏附在標本上。

(d)用流動的自來水徹底清洗玻片，直至顏色從乳膠中而不是細胞中除去。

1. 遵守當地處理放射性核素的規則。由于這些規則不同， 沒有特殊的規定可利用。注意事項如下：戴手套， 不要在水平層流中工作， 使用具有吸收襯墊的淺盤以容納任何意外溢出的液體， 在標有用于放射活性的盒或盤中孵育細胞，按照當地的規定處理放射活性廢物。

2. 由于 ³H-單核苷酸的最終定位是 DNA ，毒性很高。