傳統的熒光定量PCR,經過多年的發展,已是很成熟的實驗方案了。其中,最常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在這二種方法當中,Taqman法又以其特異性高、定量精確,得到廣大用戶的認可。但是Taqman法PCR,它還是一個相對定量的辦法。它測的是一個Ct值,也就是PCR到第幾個循環,熒光強度達到了一個設定值。要想用Taqman方法得到:樣本中到底有幾個目標基因的拷貝,那么還是要再做一個標準品的(qPCR)曲線。才能知道樣本的Ct值落在標準曲線的哪個位置上。再進一步推算出樣本中的拷貝數量。這樣做既增加了工作量,因為引入了標準品,又多引入了一個實驗的誤差變量。
新發明的微滴數字PCR采用一種全新的方式進行核酸分子的定量,與傳統PCR、定量PCR相比,其結果的精確度、準確性和靈敏度更佳。定量的結果不再依賴于Ct值,直接給出靶序列的起始濃度,實現真正意義上的絕對定量。微滴數字PCR的原理,就是把原來一整管的PCR反應液,分散成幾萬個,甚至幾百萬個極微小的液滴。這些小微滴同時進行PCR反應,這樣就可以計算出原來的反應液當中,有多少個目標基因的拷貝了。
隨著數字PCR技術不斷發展,Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等廠家相繼推出技術較為成熟的數字PCR產品:
1、LIFE Technologies 3D數字PCR(芯片式數字PCR):。在芯片上預制了2萬個小孔,把PCR反應液,物理地注入到芯片上的小孔中,密封后,進行PCR反應,PCR反應結束后,采用CCD拍照,數陽性反應孔。
2、Bio-Rad的微滴數字PCR(油包水原理):實際上是QuantaLife公司開發出的微滴數字PCR技術,該產品還獲得了2011年度Frost & Sullivan北美新產品創新獎。2011年10月,Bio-Rad公司收購了QuantaLife和ddPCR技術,相繼推出了QX100、QX200微滴式數字PCR系統,即將20ul反應體系采用液滴反應器形成20000個油包水反應體系,PCR反應結束后,才有流式細胞術的原理,檢測每一個液體,數陽性反應的液滴數量。
3、的數字PCR(油包水原理)、原理與伯樂微滴數字PCR相同,但是其液體形成能力比伯樂強很多,理論上可以產生1000萬個小油滴。價格從高到底:Raindance、Bio-Rad、LIFE Technologies。
ddPCR應用領域
(ddPCR) 系統可對DNA或RNA分子進行絕對定量分析,適用于 EvaGreen 或基于探針的數字PCR應用領域。包括:
(1) 癌癥生物標志物研究和拷貝數變異分析
以卓越的靈敏度和準確度測量癌癥突變的變異程度、檢測稀有的 DNA 靶拷貝以及解析拷貝數變異狀態。
(2) 病原體檢測
精確地對靶 DNA 或 RNA 分子中的細微變化進行定量分析,從而檢測和監測病原體。
(3) 與新一代測序 無縫對接
無需使用標準曲線,直接對 NGS 庫執行絕對定量分析。
(4) 基因表達分析
可對少量 mRNA 和 miRNA 的細微變化進行準確及重復性極佳的檢測。
(5) 環境監測,例如土壤和水。
(6) 食品檢測,采用經過驗證的 ddPCR 方法對轉基因生物體 (GMO) 進行評估。