新一代高效多重熒光原位雜交技術研制成功

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近日，華中農業大學教授曹罡、副研究員戴金霞團隊在《自然—通訊》發表新一代效率高、特異性強、信號強和背景噪音低的熒光原位雜交方法—p-FISH rainbow，突破了現有的技術壁壘，克服了目前熒光原位雜交技術領域的缺陷和不足，可廣泛應用于動物、植物和病原微生物中多種生物分子的高效檢測、細胞亞群和空間圖譜的原位注釋、染色體變異原位驗證、多重蛋白共同檢測和短核酸序列的檢測，為生命科學研究和臨床診斷提供了有力的工具。

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π-FISH rainbow技術可同時檢測多種生物分子，實現一網打盡。華中農大供圖

生命體的細胞功能多樣性源于細胞的異質性和組織環境的復雜性，確定組織環境中細胞類型和分子特性對于解析細胞—細胞相互作用和組織的功能機制尤為重要。近年來，盡管單細胞RNA測序（scRNA-seq）促進了細胞異質性的解析，卻伴隨著組織微環境和細胞空間信息的缺失，限制了對生命信息的深度解讀。熒光原位雜交技術（FISH，fluorescence in situ hybridization）通過特異性雜交解析生物分子的表達水平和空間位置，極大地促進了細胞中基因空間表達信息的探究，加速了我們對組織微環境和功能機制的深入理解。

盡管目前熒光原位雜交技術經過不斷地改進已經取得了巨大的進步，但仍存在一些挑戰：當前方法通常需要大約1kb或更長的核酸序列用于多個靶標探針的雜交，才能產生足夠的信號強度，限制了對短核酸序的檢測；只能單獨檢測DNA、RNA和蛋白質，或共同檢測RNA和蛋白質，還沒有有效方法同時檢測DNA、RNA和蛋白質；如何在實現高雜交效率和高信號強度的同時，保證低背景噪音仍然是原位雜交技術的一個關鍵挑戰。

針對當前熒光原位雜交技術面臨的挑戰，該團隊開發了雜交效率高、信號放大能力強、背景噪音低、特異性好、檢測通量高、應用范圍廣的新型熒光原位雜交方法—π-FISH rainbow。

該方法具備高度創新性和優越性。新型π型靶探針(含2-4個互補堿基對)和U形放大探針的設計使該方法比目前主流的FISH方法，如smFISH和HCR等，雜交效率更高、背景噪音更低和信號放大能力更強。

該方法可以實現DNA、RNA和蛋白質多重分子的共同檢測，這一突破對破譯生物大分子復合物參與生命活動調控機制的研究具有十分重要的意義。

目前的熒光原位雜交技術方法還無法克服短序列的限制，難以實現對短序列RNA（如microRNA）、短序列DNA（如DNA突變、倒位、異位）以及可變剪接等分子的檢測。π-FISH rainbow方法可以高效檢測上述短核酸序列分子的空間信息

該方法應用范圍非常廣泛，可用于動物、植物和微生物（細菌，病毒和寄生蟲等）樣品的檢測，并且不拘泥于樣本制備的限制，可適用于冰凍樣本、石蠟樣本和整體胚胎樣本的檢測。

該研究利用π-FISH rainbow方法探究了重要的生物學問題并獲得了新的發現。

他們成功鑒定了前列腺癌患者循環腫瘤細胞中雄激素治療抵抗標志物雄激素受體剪接變體7 (ARV7)，解決了前列腺癌治療中缺乏精準診斷的難題，為前列腺癌患者雄激素耐藥性治療提供了重要的臨床指導。

該方法通過4個熒光通道組合編碼，每輪可同時實現15個基因的檢測，從而在同一張小鼠初級感覺皮層（S1）組織切片上通過兩輪雜交檢測了21個神經元的標記基因，不僅再現了小鼠S1皮層不同亞層神經元的空間分布，而且繪制了小鼠S1皮層中13個抑制性神經元亞群的空間圖譜

由于π-FISH rainbow的高靈敏度，該研究首次發現腫瘤細胞周期關鍵調控因子lncRNA MALAT1具有三種不同的亞細胞定位模式。其中，MALAT1的核聚集模式顯示與miR145-5p的高度共定位。

這些研究展現了π-FISH rainbow技術在基礎科學研究和臨床診斷中的巨大應用潛力。

曹罡、戴金霞為共同通訊作者，博士研究生陶影峰和周小六為共同第一作者。該研究得到了國家自然科學基金、廣東省重點研發計劃、中央高校基本科研業務費專項資金項目的資助。