這里，很多經常遇到的問題，比如引物設計，PCR體系和條件，電泳條帶分析等，我沒有一一詳細列舉，因為這些原因比較容易找到，我這里列舉的可能多是些容易忽略的疑難雜癥，希望對大家有幫助。（說了是疑難雜癥了，可能有一些看法走極端了，但是為了做出實驗，懷疑一切，狗急跳墻，沒事找抽也是值得的）。
1.引物設計
引物的參數合理控制，像發卡結構，錯配，二聚體等，只要別太過分，問題應該不大，當然沒有最好，個人感覺上下游兩條引物的退火溫度這個參數比較重要，讓兩條引物的退火溫度盡量接近，不然后果很嚴重。
2.RNA提取
試劑盡量用新的，用自己的，不知道情況的不要用，如果對RNA 不放心，特別是以前提的RNA，重新反轉，用RNA電泳一下看看，我直接用DNA電泳的條件電泳RNA的，應該沒問題，RNA酶是存在廣泛，但還沒強到這么短的時間就分解吧（個人感覺的，反正我能跑出RNA條帶）。
3.反轉錄
如果RNA表達比較少不妨多加點RNA反轉；oligodT只反轉真核生物mRNA，但是是從3’端開始的，如果你的目的片段在5’端，且目的基因很長，不妨試試隨機引物，但隨即引物反轉的產物95%以上都是rRNA。
4.PCR
1.操作，快而準確，PCR出問題時不妨換個人做做試試，當你反復多次做不出結果是，很有可能這個原因，先懷疑自己，再懷疑試劑和儀器，畢竟，它們都比人（的操作）穩定；
2.PCR儀，換個實驗室，用別人的PCR儀做個試試；
3.taq酶，個人感覺各個品牌的酶有差別但不是很大，關鍵酶用了多長時間，太長當然不好，用配套的buffer，以前剩的buffer就不要用了，該浪費就浪費吧，吃壞東西會拉肚子的；
4.模板，能做出內參不一定能做出目的條帶，內參表達比較多，降解一點也不會影響，目的條帶就不一定了，特別是目的片段在5’端時，因為DNA/RNA是從5’開始降解的；
5.水，用壓過的去離子水，不然可能會有蛋白酶污染；
6.EP管，也要壓過的，另外國產的不行換進口的試試，不是我崇洋媚外，國產貨實在太不爭氣了，我用國產管和進口管做明顯有差異；
7.程序，PCR時設的程序不光可以調退火溫度，做不出來時，不妨調下延伸時間，還有開始時變性的時間都可以試試，試試而已，反正你現在做不出來；
8.溫度，不要局限于G+C或引物說明書的退火溫度，擴大范圍，廣撒網；
5.電泳，電壓調低點，時間長點，膠濃度大點試試，別忘加EB（我犯過的低級錯誤）
確定成像儀正常工作，要是你做的很好，而最后成像出問題了，那多冤呀。
另外當實驗多次無法做出結果時，不妨試試按部就班的排除各個因素，雖然這樣有點慢，但總比做不出來好
1.讓別人給你提RNA，做反轉，然后讓別人給你做次PCR，你自己用這個模板也做一次，確定是反轉之前出的問題，還是反轉之后的問題，如果人家能作出來而你做不出來，同樣的模板，那就是后面PCR的原因了。
2.自己用同樣的模板加兩份樣，一份給別人做PCR和電泳，一份自己做，如果人家作出來了，你沒作出來，那說明你的操作和體系沒有問題（懷疑自己操作的，可以在實驗室找個人幫你加樣），電泳和成像有問題，還很有可能是PCR儀的問題，不要說實驗室其他人用它能作出來呀，說不定你的目的條帶比較特殊，比較嬌氣呢；
如果你倆都沒做出來，那就是你的操作和體系的原因了（因為1中別人給你做出來過，所以看看他的操作和體系跟你有么差別），具體看上面，細節很多，每個都可能是。
3.如果第二步別人能做出來，你不能，那讓他再給你做一次（如果你覺得麻煩他太多次了，告訴他這是最后一次了），PCR完了后，一部分讓他給你電泳，一部分自己拿回來電泳，看看是不是電泳的問題。電泳的條件和PCR的條件可以問問別人，任何一個小的差異都值得嘗試一下。
我也是個剛接觸PCR六周的新手，如果這里面有錯誤的地方，大家及時提醒我一下，還有其他的容易忽略的問題我沒想到的，希望各位高手補充，盡量不要再讓這些小問題浪費我們大量的時間了。