一、電印跡和染蛋白1.將蛋白質電印跡到硝酸纖維膜或 PVDF 膜上。一般 0.5 mm 厚的凝膠，轉膜需要 2 h。對于很難轉移的蛋白質，可在轉移緩沖液中加入 0.005% 的 SDS。硝酸纖維膜要比 PVDF 膜易于轉移，因為 PVDF 膜有不易被水沾濕的表面，限制了肽段的回收。因而，硝酸纖維膜具有較高的肽段回收效率。 注意：在氨基末端序列測定之后，不可能再進行 PVDF 膜上的消化。
因為硝酸纖維素對于 Edman 化學試劑和溶劑是非惰性的，所以這種膜不能直接用于氨基末端序列分析。胺黑和麗春紅 S 染色不影響蛋白質消化、從膜上提取肽段和隨后的 RP-HPLC 肽段分析。 2.用胺黑或麗春紅 S 染膜。用胺黑染：（1）把硝酸纖維膜或 PVDF 膜浸在 0.1% 胺黑 10B 染色液中，保持 1~3 mm。 （2）用水/乙酸/甲醇混合液快速沖洗幾次膜，使之脫色。 （3）用去離子水徹底沖洗脫色后的印跡膜，去除過量的乙酸。 （4）剪下染色的蛋白條帶（對于二維電泳，剪下蛋白點，一塊膠上需要 40 個點），并把這些條帶轉移到 1.5 ml 的小離心管中，立即進行下面的操作步驟③，或儲存在—20℃。 用麗春紅 S 染：（1）將硝酸纖維膜浸在 0.1% 的麗春紅 S 中，染色 lmin。 （2）在 1% 的乙酸水溶液中輕輕攪動膜 1~3 min，去掉多余的染色液。 （3）剪下目標蛋白質條帶，把它們轉移到小離心管中。 （4）用 200 mmol/L 的 NaOH 洗 1~2 min，進行蛋白質條帶脫色。 （5）用去離子水洗蛋白質條帶, 立即進行下面的操作步驟③，或保濕儲存在-20 °C(避免過分干燥）。 二、結合在膜上的蛋白質消化1.將 I.2 ml 溶解于 100 mmol/L 乙酸中的 5 g/LPVP-40 加入到離心管中。 2.37°C 孵育 30 min。 3.1000g 離心 5 min。 4.棄掉上清液。 5.離心管中加入約 1ml 水。 在 RP-HPLC 肽譜作圖之前，有必要去掉多余的 PVP-40，因為 PVP-4 〇吸收紫外線的能力非常強；而且 PVP-40 分解后的產物，會在電噴霧離子化質譜（ESI-MS) 中產生污染峰。 6.旋轉離心管 5s。 7.重復步驟3和步驟4。 8.重復步驟5~6一次。 9.把硝酸纖維膜剪成小塊（約 1mmX1mm), 將它們放到新的離心管（0.5 ml 或 0.2 ml) 中。 10.加入極少量的消化液（10~20ul），覆蓋小塊的膜。 11.37°C 放置 16 h 或過夜進行消化后，把整個反應混合物加樣到 Rp—HPLC 柱，分離肽段組分（或-20℃ 儲存肽段混合物直到使用）。 展開 | 