一、SDS-PAGE 分離的 Gab-I 蛋白的消化1.把通過自顯影確定的含有磷酸化蛋白的條帶切下來。 2.將凝膠切成 1mm2 的條帶，把它們放到檢測管中。 用特定的不含 Na+、K+的試管消化，否則 Na+、K+的化合物會在 MS 中出現。 3.用消化緩沖液 A 洗凝膠條，37°C，lOmin。 4.用消化緩沖液 B 洗凝膠條，37°C，lOmin。 5.重復③、④步兩次以上。 6.室溫下加乙腈使凝膠條帶脫水，直到膠條變白（約 3 min)。 7.加蛋白酶溶液，37°C，20 min，使凝膠膨脹。 酶解溫度取決于所用的蛋白酶（例如，Glu-C 需要在 25°C，而胰蛋白酶需要在 37°C)。 8.在凝膠塊上加消化緩沖液 A 防止其干燥，37°C 下孵育過夜。 二、用于陰離子交換色譜的凝膠條帶的抽提9.加 20ul 消化緩沖液 A 到凝膠中，4°C 下超聲 20 min。 10.收集上清。 11.重復⑨、⑩步兩次以上。 三、陰離子交換色譜12.調整陰離子交換柱的流速為0.5 ml/min。 13.把合并的上清液，加到柱子上。 14.用離子交換緩沖液 A 洗柱子 20 min。 15.用呈現 0~10% 的梯度離子交換緩沖液 B，從柱子上洗脫多肽，持續 40 min，在洗脫過程中每分鐘收集0.5 ml 的洗脫液。
 16.提高離子交換緩沖液 B 的梯度，即 10%~50%，持續 75 min。 17.用 Cerenkov 計數器測量每一組分的放射性，或測量經閃爍放大的每一組分的放射性。 18.按每一部分的相對放射性對洗脫時間作圖（例子見圖 9.14)。 四、對有放射性的洗脫液作 RP-HPLC 色譜分析19.從陰離子交換色譜洗脫液中選一個具有放射性的組分。 20.用一個離心干燥器將其體積由 500ul 減小到 80ul。 21.調整 M-HPLC 柱的流速到 704/min。 22.用一個死體積 T-分流器調整 y-HPLC 柱子的流速到 16ul/min。 23.把樣品加到一個 80ul 的進樣環管中。 24.用 95% 的 pRP-HPLC 緩沖液 A 洗柱子 30 min。 25.UV 檢測器調零，光度計的采樣頻率設為 2 Hz，在 215nm 和 295nm 下對 RP-HPLC 洗脫液進行 UV 檢測。 26.用 5%~50% 的梯度 JLtRP-HPLC 緩沖液 B 洗脫，持續 90 min。 27.收集洗脫液，使每一組分的體積為 8~16ul。 28.從每一組分中取 0.5ul 轉移到小瓶中進行放射性的測量。 組分的體積依賴于峰的大小 29.將這些組分在-70°C 下迅速冷卻，圖 9.15 顯示了一個典型的 RP-HPLC 色譜圖。
 五、對于放射性的組分作 MALDI-MS 分析30.從 RP-HPLC 中選一個具有放射性的組分，把0.3ul 的收集液加到不銹鋼的 MALDI 板上。 31.加 0.3ul 的基質溶液到樣品上，空氣中自然干燥（約 1 min)。 32.以線性或反射的模式記錄 MALDI 譜圖（見圖 9.16)。 33.把從 MALDI-MS 譜圖中獲得的理論計算（inSilic0) 的多肽質量與理論消化憐酸化蛋白（如 GPMAW，Protein-Prospector) 所獲得的實驗性質量進行比較。要考慮以下幾個方面： （1）甲硫氨酸的氧化； （2）氨基端的乙酰化； （3）S、T、Y 的磷酸化（本實例中是 Y 的磷酸化）； （4）XXRQXX 和 XXKQXX 上焦谷氨酸的產生； （5）不完全消化。
 34.選擇可能的鱗酸化多肽做 MALDI-PSD 分析。圖 9.17 和圖 9.18 顯示了磷酸化酪氨酸多肽的 4 種不同 MALDI-PSD 譜圖。圖 9.19 中顯示了多肽一般的片段化模式。
 展開 | 