時間分辨熒光技術原理

時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。  

（一）TRFIA分析原理  

在生物流體和血清中的許多復合物和蛋白本身就可以發熒光，因此使用傳統的發色團進而進行熒光檢測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此將長衰減壽命的標記物與時間分辨熒光技術相結合，就可以使瞬時熒光干擾減到最小化。  

時間分辨熒光分析法（TRFIA）實際上是在熒光分析（FIA）的基礎上發展起來的，它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長與其激發波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響，同時，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發光不在同一直線上，激發光不能直接到達光電接受器，從而大幅度地提高了光學分析的靈敏度。但是，當進行超微量分析的時候，激發光的雜散光的影響就顯得嚴重了。因此，解決激發光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。  

解決雜散光影響的最好方法當然是測量時沒有激發光的存在。但普通的熒光標志物熒光壽命非常短，激發光消失，熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的熒光壽命較長，可達1～2ms，能夠滿足測量要求，因此而產生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標記物，在關閉激發光后再測定熒光強度的分析方法。

平時常用的稀土金屬主要是Eu（銪）和Tb（鋱），Eu熒光壽命1ms，在水中不穩定，但加入增強劑后可以克服；Tb熒光壽命1.6ms，水中穩定，但其熒光波長短、散射嚴重、能量大易使組分分解，因此從測量方法學上看Tb很好，但不適合用于生物分析，故Eu最為常用。  

（二）時間分辨信號原理  

普通物質熒光光譜分為激發光譜和發射光譜，在選擇熒光物質作為標記物時，必須考慮激發光譜和發射光譜之間的波長差，即Stakes位移的大小。如果Stakes位移小，激發光譜和發射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測結果的準確性。鑭系元素的熒光光譜有較大的Stakes位移，最大可達290nm，激發光譜和發射光譜間不會相互重疊，加上其發射的光譜信號峰很窄，熒光壽命長，銪的熒光壽命可達730us，檢測中只要在每個激發光脈沖過后采用延緩測量時間的方式，待短壽命的背景熒光衰變消失后，再打開取樣門儀器記錄長壽命銪鰲合物發射的特異性熒光，可以避免本底熒光干擾，提高檢測的精密度。

TRFIA的測量儀器是時間分辨熒光計，由三大部分組成：光源：脈沖光源：氙燈（每秒閃爍1000次）；小型N2激光器；輸出脈沖波長：337nm熒光信號獲取系統；數據處理系統。  

（三）解離增強原理  

解離增強鑭系元素熒光免疫分析（DELFIA）是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體／抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體／抗原，經過免疫反應之后生成免疫復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3+從復合物上解離下來，自由Eu3+同增強劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態分子團，這種分子團在紫外光的激發下能發出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。這是目前在時間分辨熒光免疫分析中應用最多的一種分析系統。  

（四）TR-FIA應用  

1.激素：甲狀腺激素、甾體類激素。  

2.病毒性肝炎標志物。  

3.腫瘤相關抗原。  

4.藥物。  

5.多肽類。  

（五）TRFIA技術為臨床檢測帶來的先進性：