昆明小鼠原位胃癌移植模型的建立實驗

昆明小鼠人胃低分化腺癌細胞系SGC7901

1640 培養基VEGF抗體抗兔Envision抗體兔抗鼠CD31 抗體H2O2PBS抗VEGF抗體蘇木素DAB顯色液二甲苯石蠟甲醛青霉素鏈霉素戊巴比妥鈉

OB膠手術剪一次性注射針頭微波爐光學顯微鏡

一、昆明小鼠皮下移植瘤傳代

S180 細胞注人小鼠腹腔內， 進行體外培養，5 -7 d 可見小鼠腹部腫脹，有腹水，收集腹水， 細胞計數，調整細胞密度在2 x 10⁶- 2x 10⁷注射到昆明小鼠的腋部皮下形成實體瘤。待腫瘤生長至直徑1.5 -2.0 cm 之間，處死小鼠，按上述方法反復傳3 代后作為原位移植用瘤源。
 

二、 原位移植模型的建立

1.  取一中傳3 代后生長4 周左右處于對數生長期的昆明小鼠， 常規消毒，從腋部皮下剝取腫瘤組織。

2.  剔除纖維包膜、血管，切開去除中間壞死的組織，選取生長良好、呈淡紅色、魚肉狀的瘤組織，剪成約1-2 mm ，小塊備用。

3.  昆明小鼠術前禁食12 h， 以0.5% 戊巴比妥鈉腹腔內注射(50 mg/kg)麻醉， 固定小鼠，常規消毒皮膚，用手術剪刀在小鼠沿左側腹部正中旁線切開，切口約1.5 cm ，小心暴露腹膜、胃壁，用一次性注射針頭輕微損傷胃大彎中部漿膜層， 以出血為度，用無齒鑷將破損處向內推壓，使局部胃壁形成凹完，植入1 塊1-2 mm³ 瘤組織塊，并在瘤表面滴1 滴OB生物膠， 使其覆蓋瘤組織表面， 然后分層關腹。

4.  人胃癌組織塊昆明小鼠原位種植后， 逐日觀察裸鼠全身狀況，運動情況，腹部體征。若實驗過程中出現動物死亡，記錄時間， 并全面探查腹腔，觀察胃腫瘤原位生長情況。

三、 處死動物及移植瘤的觀察
 

定時觀察所有裸鼠全身狀況、運動情況、腹部體征、移植后脫頸處死解剖，取原位瘤。所取標本經10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，做組織病理學檢查。
 

四、免疫組化染色
 

1.  采用EnVision免疫組織化學技術檢測VEGF蛋白表達。EnVision是一種兩步法免疫組化新技術，具有簡便、特

異和敏感等特點。

2.  操作步驟如下，選取薄(3-4 um)而平整的組織切片，浸二甲苯脫蠟， 梯度酒精水化后微波修復抗原，室溫冷卻后PBS 洗滌5 min。

3.  切片放人H₂O₂液中封閉10 min，PBS 洗滌5 min，滴加1:100稀釋的抗VEGF抗體置于37 ℃ 恒溫孵育60 min，PBS 洗滌5 min。

4.  滴加二抗置于37℃恒溫孵育30 min，PBS 洗滌5 min。

5.  DAB顯色液顯色，室溫下染色時間約8-20 min，在顯微鏡下根據顏色的發展掌握染色時間。

6.  顯色結束后放人PBS 洗滌5 min，蘇木素復染，封片。

7.  以PBS 代替一抗為陰性對照。

8.  VEGF陽性結果判斷：隨機取5 個高倍視野，以其陽性細胞百分比計，≤5 % 為陰性(+) ，6%-25 % 為弱陽性( + ) ，26%-50%為中等強度陽性( + + )，≥51 % 為強陽性( ++ + ) 。

五、 移植瘤微血管密度的測定
 

1.  采用EnVision 法，方法同4 ，一抗為兔抗鼠CD31 抗體，稀釋倍數為1：10 0 。

2.  用PBS 代替一抗作為陰性對照。

3.  移植瘤MvD 按照Weidner等的評判標準， 計算腫瘤內著色的毛細血管和微小血管， 凡呈現棕色單個內皮細胞或內皮細胞群者均作為1 個血管計數，但肌層較厚及管腔面積大于8 個紅細胞直徑的血管不計數。

4.  首先在100x 鏡下尋找血管數目最高的區域， 然后在200x 鏡下計數5個區域中的微血管數目，取均值代表。

六、 統計學處理

移植瘤MVD資料用無士SD 表示，采用t 檢驗。

光鏡下胃移植瘤細胞多呈橢圓形、核大、深染、病理性分裂相多見。瘤細胞排列呈巢狀或索狀,無明顯腺體結構存在,在胃壁中浸潤性生長。

人 胃癌裸 鼠移植模型 經歷 了細 胞懸 液皮下接種 、細胞懸液胃壁處接種及完整組織塊 胃壁內移植 3個代表性階段。腫瘤細胞懸液注射裸鼠胃壁形成的原位移植模型最易發生類似人類腫瘤的轉移過程。

參考：《昆明小鼠與裸鼠原位胃癌模型的比較》藥物生物技術，2011，18（5）