顯微鏡的構造、性能和使用方法實驗（一）

實驗方法原理 微生物學研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10×）、高倍物鏡（4mm，40—45×）和油鏡（1．8 mm，95—100×）三種。油鏡通常標有黑圈或紅圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字樣表示，它是三者中放大倍數最大的。根據使用不同放大倍數的目鏡，可使被檢物體放大1000—2 000多倍。從圖Ⅲ-3中可看出油鏡的焦距和工作距離（標本在焦點上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時，鏡頭離標本十分近，需特別小心。

使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，與玻璃相同。當光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進入物鏡而不發生折射。如果玻片與物鏡之間的介質為空氣，則稱為干燥系，當光線通過玻片后，受到折射發生散射現象，進入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度（圖Ⅲ-4）。

利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數值孔徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數值孔徑決定的。所謂數值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：

NA＝n?sinα

式中NA=數值孔徑；

n=介質折射率；

α=最大入射角的半數，即鏡口角的半數。　

因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大（圖Ⅲ-5），該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。

同時，α的理論限度為90°，sin90°=1，故以空氣為介質時（n=1），數值孔徑不能超過1，如以香柏油為介質時，則n增大，其數值孔徑也隨之增大。如光線入射角為120°，其半數的正弦為sin60°=0．87，則：

以空氣為介質時：

NA=1×0．87=0．87

以水為介質時：

NA=1．33×0．87=1．15

以香柏油為介質時：

NA=1．52×0．87=1．32

顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與物鏡的數值孔徑成正比，與光波長度成反比。因此，物鏡的數值孔徑愈大，光波波長越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細微結構也愈能明晰地區別出來。因此，一個高的分辨力意味著一個小的可分辨距離，這兩個因素是成反比關系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來表示的。

式中λ=光波波長。

我們肉眼所能感受的光波平均長度為0．55μm，假如數值孔徑為0．65的高倍物鏡，它能辨別兩點之間的距離為0．42μm。而在0．42μm以下的兩點之間的距離就分辨不出，即使用倍數更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用數值孔徑更大的物鏡，增加其分辨力才行。例如用數值孔徑為1．25的油鏡時，能辨別兩點之間的

因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍物鏡（NA=0．65），和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有0．42μm。假如采用放大率為90倍的油鏡（NA=1．25），和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出0．22μm間的距離。

實驗材料 標本

試劑、試劑盒 二甲苯

儀器、耗材 顯微鏡顯微鏡燈香柏油

實驗步驟

1.  觀察前的準備

（1）置顯微鏡于平穩的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約3—4cm。鏡檢者姿勢要端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必須同時睜開，以減少疲勞，亦可練習左右眼均能觀察。

（2）調節光源，對光時應避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。

調節光源時，先將光圈完全開放，升高聚光鏡至與載物臺同樣高，否則使用油鏡時光線較暗。然后轉下低倍鏡觀察光源強弱，調節反光鏡，光線較強的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。

在對光時，要使全視野內為均勻的明亮度。凡檢查染色標本時，光線應強；檢查未染色標本時，光線不宜太強。可通過擴大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉反光鏡調節光線。

2.  低倍鏡觀察

檢查的標本需先用低倍鏡觀察，因為低倍鏡視野較大，易發現目標和確定檢查的位置。

將金黃色葡萄球菌染色標本置鏡臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使觀察對象處在物鏡正下方，轉動粗調節器，使物鏡降至距標本約0．5cm處，由目鏡觀察，此時可適當地縮小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時用粗調節器慢慢升起鏡筒，直至物像出現后再用細調節器調節到物像清楚時為止，然后移動標本，認真觀察標本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準備用高倍鏡觀察。

3.  高倍鏡觀察

將高倍鏡轉至正下方，在轉換物鏡時，需用眼睛在側面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后由目鏡觀察，并仔細調節光圈，使光線的明亮度適宜，同時用粗調節器慢慢升起鏡筒至物像出現后，再用細調節器調節至物像清晰為止，找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視野中心，準備用油鏡觀察。

4.  油鏡觀察

（1）用粗調節器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉至正下方。

（2）在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

（3）從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標本相接，應特別注意不能壓在標本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。

（4）從接目鏡內觀察，進一步調節光線，使光線明亮，再用粗調節器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現物像為止，然后用細調節器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側面觀察，將油鏡降下，重復操作至物像看清為止。

（5）用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標本。

（6）觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。

（7）將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發生碰撞危險。