更快更靈敏的timsTOFPro：為蛋白質組學而生

　　分析測試百科網訊，今年9月國際人類蛋白質組學大會（HUPO）上，布魯克公司發布timsTOF Pro捕集離子淌度飛行時間質譜，該產品獲得了由分析測試百科網組織評選的2017 ANTOP大獎，獎項名稱為“蛋白質組學創新質譜技術獎” 。BCEIA展會上，分析測試百科網編輯采訪到布魯克道爾頓中國區高級商業總監王克非博士，他將為我們詳解timsTOF Pro的創新。這是布魯克繼去年ASMS推出震撼的timsTOF離子淌度飛行時間質譜后，推出的第二款創新離子淌度質譜產品；也是迄今為止專用于蛋白質組學的離子淌度質譜產品。希望通過本文，為從事蛋白質組學研究的質譜實驗室帶來新的啟發和新的強有力的工具。

布魯克道爾頓中國區高級商業總監 王克非 博士

　　談到timsTOF Pro新產品的意義，王克非博士首先表示，這是布魯克近5年推出的最重要的新產品之一。這里的Pro不是升級換代的意義，而是指蛋白質組學（Proteomics）。該產品目前主要為shotgun鳥槍法蛋白質組學服務，其中的一些功能未來也可用于代謝組學，目前主要應用于bottom-up proteomics（自下而上的蛋白質組學）。

timsTOF Pro的特點和優勢

timsTOF Pro捕集離子淌度飛行時間質譜

　　該產品為蛋白質組學用戶帶來的重要好處是：更快，更靈敏，鑒定出更多的蛋白。

更快的高分辨MS/MS

　　timsTOF Pro捕集離子淌度飛行時間質譜通過離子淌度（ion mobility）分離后，利用四極桿進行快速掃描，再送入碰撞室CID碰撞后，到TOF中進行高分辨的MS/MS測定。在整個LC-MS/MS流程中，每秒可以獲得100-150張高分辨的MS/MS譜，且可保持40,000-50,000高的分辨率，達到業界最高的水平。關于這一點，小編還追問了王克非博士，采集MS/MS圖譜時，比較所有其它質譜，Q-TOF是唯一可以獲得20,000-50,000的高分辨MS/MS的質譜類型（Orbitrap在做shotgun蛋白質實驗室，其MS/MS圖譜通常只有7,500的分辨率），而timsTOF Pro不僅可以達到40,000-50,000的MS/MS分辨率，而且可以達到業界最快的每秒100-150次MS/MS的采集速度（Orbitrap的最快MS/MS速度為每秒40次MS/MS）。

更靈敏

　　由于timsTOF Pro有更快的采集速度，在有些情況下，有些離子可以掃描多次，從而累積離子，獲得更高的靈敏度，若以平均每個母離子掃描3次計，這就使得靈敏度提高了3倍。為用戶帶來的好處是：首先可以鑒定到更低豐度的蛋白，其次可以使用更少的樣品。

鑒定出更多的蛋白質

　　更快、更靈敏，在鳥槍法蛋白質組學中，最終帶來的結果是，可以在一次實驗中，鑒定更多的蛋白質。比如，在200ng HeLa Digest（人宮頸癌細胞酶解物）樣品中，可以通過90分鐘的LC-MS實驗，鑒定5,200多個蛋白質，達到業界最高的水平。

timsTOF Pro的工作原理：雙TIMS和PASEF

　　離子淌度為LC-MS增加了除了液相保留時間、m/z外的新維度的分離，主要根據分子的形狀進行分離，為復雜體系樣品的測定帶來了巨大的想象力。但在蛋白質組學這種超復雜的體系測定中，淌度分離的時間一般為30-100毫秒，那么這段時間內的淌度分離時間就不再能接受LC流出的樣品，因此就造成了樣品的丟失，離子利用率大打折扣。

　　timsTOF Pro創新性地使用了雙TIMS分離/富集裝置，離子在第一個TIMS部分中進行累積，然后在第二個TIMS中根據淌度進行分離，經過分離后的離子繼續用于MS/MS碎裂。隨后重復該步驟，在該過程中，當第二個TIMS進行分離時，第一個TIMS也同時在平行地累積離子，這樣可以實現近乎100％的離子利用率。使用這種PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation平行累積串行碎裂）技術[1]，可以為納升LCMS分析酶解蛋白質混合物的工作提供優異的穩定性。

timsTOF Pro的雙TIMS，同步的四極桿質量過濾器，高速碰撞池，高分辨UHR-TOF

　　 PASEF技術代表了一種革命性的創新，為鳥槍法蛋白質組學提供了更高的靈敏度和更快的速度，并且不損失質量分辨率。在鳥槍法蛋白質組中經常使用的基于傅立葉變換的質譜，存在掃描速度有限以及提高掃描速度時會降低質譜分辨率的問題。而現在PASEF技術解決了這個問題，憑借近100％的離子利用率，可以在母離子和子離子掃描過程中，在保持質譜超高分辨率的同時獲得更高的靈敏度。這種PASEF技術使timsTOF Pro成為科學家們的得力工具。可幫助他們對復雜樣品的分子機制進行更深入的研究、提高發現低豐度生物學重要蛋白質的可能性；在轉化醫學、臨床蛋白質組學研究中進行大批量驗證和縱向研究。

　　定量蛋白質組學是蛋白質組學研究的一個關鍵領域。與傳統的基于門控技術、時間串聯技術和傅立葉變換技術的質譜相比，雙TIMS-powered的PASEF技術具備顯著的優勢。新的timsTOF Pro在低上樣量（100-200ng）的情況下超過四個數量級的動態范圍。使其適用于小細胞群體的蛋白質組學和生物研究和臨床研究中經常遇到的低豐度樣品。

　　德國 Max Planck Institute of Biochemistry的蛋白質組學和信號轉導系主任Matthias Mann 說：“我的實驗室與布魯克合作開發PASEF技術，我們很高興看到timsTOF Pro實現了我們最初設想的鳥槍法蛋白質組學的潛力。這種新技術有可能革新蛋白質組學的幾個領域：在需要運行大批量樣品中確保速度和穩定性的臨床研究；需要增加靈敏度的應用，例如磷酸化多肽的富集實驗或數量有限的待分析細胞；使用同位素標簽的定量實驗，由于附加的離子淌度至少能部分去除由共洗脫峰帶來的污染物，從而避免了由污染物帶來的同位素抑制效應和由此產生的誤差。我們同時也對該技術進一步發展的潛力感到非常興奮。”王克非博士表示，timsTOF Pro正是和Matthias Mann教授合作的杰出成果。

PASEF 周期：通過將四極桿與 TIMS 離子逐出時間同步, 在100毫秒內平均可碎裂12個母離子（相當于每秒采集>100張MS/MS），智能軟件可針對低豐度母離子進行多次PASEF MS/MS碎裂

　　王克非博士也談到了timsTOF Pro和布魯克2016年推出的timsTOF的區別，主要有三點：（1）timsTOF只有一個TIMS離子漏斗，而timsTOF Pro有兩個TIMS漏斗；（2）在采集方式和工作流Workflow上，timsTOF Pro專門為蛋白質組學做了優化；（3）timsTOF可以精細調節離子淌度分辨率，最高可達到200，更適應于研究小分子或其它需要精細研究的領域，而timsTOF Pro的淌度分辨率固定在40-50，專門為高復雜度的鳥槍法蛋白質組學設計。

離子淌度未來的發展空間

　　離子淌度是上世紀60年代提出的技術，迄今已有很多商品化儀器，包括獨立的離子遷移譜，用于質譜前端提高信噪比的離子淌度裝置，以及離子淌度Q-TOF質譜。談到離子淌度的未來，王克非博士談到本屆BCEIA學術會議上大家討論的熱點。離子淌度已經被證實可以成功地實現分離，除此之外，離子淌度Q-TOF質譜在獲得淌度分離的同時，還獲得了氣態離子的CCS（碰撞截面積），那么，這個CCS是否能解釋分子的化學結構，和NMR，XRD等儀器獲得溶液中分子的結構數據如何進行比較和闡釋？報告的有些演講者談到，他們已經開始做這方面的探索，還需要同其它擅長如NMR、XRD的分析工作者結合起來開展研究。

戰略：進一步走向高端和科研 助力客戶取得Nobel獎級的成就

　　從自身業務來看，近幾年布魯克道爾頓中國的銷售都位于全球第二，僅次于美國。從用戶需求上，王克非博士談到，越來越多的客戶，尤其是一些重點高校、研究單位的實驗室，越來越愿意購買高端的質譜，購買那些具有獨特特點的質譜來開展研究工作；另一方面，質譜也在走向臨床診斷領域。布魯克原來在此方面有幾種類型的高端質譜：（1）MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF，做蛋白和大分子的分析；（2）MALDI-TOF在精準醫療中進行快速診斷檢測，如微生物鑒定質譜；（3）質譜成像。今年Nobel生理學獎獲得者之一Michael Rosbash，曾在2013年Molecular Brain上發表論文，用布魯克的MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF來研究神經肽組[2]。

　　隨著timsTOF Pro的推出以及布魯克對市場的觀察，布魯克的銷售方向也將從應用市場更加轉移到高端科研級市場，面向更多高端客戶、科研客戶。這樣的產品還包括：timsTOF Pro/timsTOF，rapifleX，FTICR MS。在石油化工中極復雜樣品的分析、小分子的代謝組學，Top-down蛋白質組學，FTICR MS仍然具有無與倫比的優勢，中科院大連化學物理研究所不久前即安裝驗收了最高端的15特斯拉的FTICR MALDI MS；再比如廣東工業大學，香港浸會大會，山東分析中心等客戶都采購了rapifleX MALDI-TOF 開展質譜成像研究。王克非博士表示：“在精準醫療的微生物鑒定質譜領域，布魯克的銷售基數大，增長也比較穩定；未來更大的突破將在科研領域。這要求我們從團隊建設方面進行優化，對營銷和技術支持人員的能力與知識結構提出更高的要求，從而更好地服務于高端科研客戶。”

　　參考文獻：

　　[1] J.Proteome Res. 2015,14,5378-5387, Parallel Accumulation – Serial Fragmentation (PASEF): Multiplying Sequencing Speed and Sensitivity by Synchronized Scans in a Trapped Ion Mobility Device

　　Florian Meier, Scarlet Beck, Niklas Grassl, Markus Lubeck, Melvin A. Park, Oliver Raether, and Matthias Mann

　　[2] Molecular Brain2013, 6:60，A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics

　　Joseph P Salisbury?, Kristin J Boggio?, Yun-Wei A Hsu, Jeniffer Quijada, Anna Sivachenko, Gabriele Gloeckner, Paul J Kowalski, Michael L Easterling, Michael Rosbash and Jeffrey N Agar