實驗概要
1、通過本實驗的學習，初步掌握植物染色體制片，奠定細胞遺傳學研究的基本技術；
2、通過對植物根尖細胞的觀察，掌握有絲分裂過程中染色體的形態特征和動態變化；
3、掌握Feulgen染色方法。
實驗原理
有絲分裂（mitosis）是植物細胞分裂的主要方式，細胞分裂過程中，核內染色體準確地復制，并有規律地、均勻地分配到兩個子細胞中去，保證了植物細胞的遺傳性狀的一致。各種生長旺盛的植物組織中，如根尖組織、莖尖組織、居間分生組織、愈傷組織等，每天都有分裂高鋒時間，此時經預處理，固定、解離、染色和涂抹壓片等方法，在顯微鏡下可以觀察到處于有絲分裂各時期的細胞和染色體。
孚爾根染色法是鑒別細胞中DNA反應的組織化學方法。細胞內的DNA(通常位于核及染色體上)在1N HCl 60℃水解時部分地破壞了脫氧核糖與嘌呤堿之間的糖苷鍵而使嘌呤堿脫掉，從而使脫氧核糖的第一個碳原子上潛在的醛基獲得了自由狀態。而無色的亞硫酸品紅是由偏重亞硫酸鈉、鹽酸和堿性品紅配制成的。偏重亞硫酸鈉與鹽酸能產生亞硫酸根，當具有醌式結構的堿性品紅分子與亞硫酸根結合后，醌式結構的共軛雙鍵被打開，堿性品紅變為無色。當用這種無色的亞硫酸品紅去染經酸解的細胞時，就會與染色體DNA上游離的醛基結合，又出現了呈現紅色的醌式結構，從而使DNA分子著色。這一反應是1924年由Feulgen 和Rossonbek 所發現和確定的，已廣泛用作鑒別DNA的一種特異性檢查方法。
主要試劑
卡諾氏固定液（冰醋酸:無水酒精=1:3）、秋水仙堿（或8－羥基喹啉）、無水乙醇、1N HCl、 45?醋酸、0.2?秋水仙素、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉（鉀）
Schiff試劑的配制
Schiff試劑：即脫色亞硫酸品紅。溶解1g堿性品紅于200ml 煮沸的重蒸餾水中，輕加搖動。繼續煮5分鐘使之完全溶解，冷卻至50-55℃時過濾到棕色試劑瓶中，冷卻至25℃時，加入20ml 1N HCl和1-3g偏重亞硫酸鉀(K2S2O5)或偏亞硫酸鈉(Na2S2O3)。搖動使溶解，密閉瓶口置黑暗低溫處或冰箱內(4℃左右)18-24h后檢查。溶液呈無色透明或淡黃色即可。如有不同程度的紅色，可加入0.5-1g活性炭，激烈震蕩1分鐘，仍在低溫下靜止1小時或過夜。然后用粗濾紙迅速過濾后使用。密封瓶口，包以黑紙，在0-5℃可以保存5-6個月。
偏重亞硫酸鉀(K2S2O5)或偏亞硫酸鈉(Na2S2O3)與1N HCl反應，放出SO2、 SO2與堿性品紅反應生成堿性品紅 —— 亞硫酸溶液，呈無色。
漂染液的配制
取10%亞硫酸鈉10 ml，加200 ml蒸餾水，再加10 ml1N HCl即可。
主要設備
水浴鍋(60℃水浴)、顯微鏡、培養箱、電子天平、酒精燈、100℃溫度計、具塞試管、吸管、濾紙條等。
實驗材料
蠶豆（Vicia faba, 2n=12）（或其它植物）干種子；洋蔥（Allium cepa, 2n=16）根尖。
實驗步驟
1、材料準備
（1）、蠶豆根尖：選取新鮮無病斑的蠶豆干種子，經日曬后，放在燒杯內，室溫下清水浸泡一晝夜。種子吸水膨脹后， 20℃左右保濕培養（雙層紗布覆蓋），待根長1－2cm時，于上午9:00－10:30或下午14:00－16:00剪下根尖備用。
（2）、洋蔥根尖：通過休眠的洋蔥鱗莖，經日曬后，置于盛有清水的小燒杯上，根部與水接觸，20－25℃光照條件下培養2－3天，待根長1－2cm時，于上午9:00－11:00剪下根尖備用。
2、預處理
為獲得較多中期分裂相的細胞，且使染色體縮短和分散，可對根尖進行預處理，方法如下（取其一即可）：
（1）、0.05％－0.2％的秋水仙堿水溶液處理2－4小時；
（2）、0.002M的8－羥基喹啉溶液處理3－4小時；
(3)、根尖浸在蒸餾水中于在1－4℃低溫下處理24小時。
3、固定
用蒸餾水洗凈材料，再用卡諾氏固定液（冰醋酸:無水酒精=1:3）（用量應為材料體積的15倍以上）室溫下固定30－60分鐘。固定的材料如暫不制片，可經90％酒精→80％酒精→70％酒精（各半小時）浸泡進行轉換，最后置于70％酒精內放入0－4℃冰箱，約可保存半年。如保存時間太長，需重新固定后再用。
4、Feulgen染色法
(1)、取經預處理并固定好的洋蔥根尖，用水洗2-3分鐘，放入室溫條件下的1N Hcl處理根尖材料2-3分鐘。
（2）、將根尖換入60℃預熱的HCl，置于恒溫水浴中，在60?0.5℃的條件下水解8-10分鐘。
（3）、吸出熱HCl，換入室溫1N HCl再處理1-2分鐘，然后水洗2-3次。
（4）、吸凈水分，加入Schiff試劑，蓋上蓋子，在黑暗條件下染色至少30分鐘，也可過夜。
（5）、漂染液沖洗三次，每次至少5分鐘去、去掉細胞中殘存的品紅分子。
（6）流水沖洗10-15分鐘，再用蒸餾水沖洗并放于蒸餾水中待用。
（6）、取根尖（紫紅色部分）置載玻片上，用鑷子夾碎后，加一滴45?醋酸，蓋上蓋片、壓片。
（每組另做未經HCl處理的為對照）
5、顯微觀察：
制備好的細胞學片子，置于顯微鏡上，先用低倍鏡（10×10）尋找具有分裂相的細胞，再轉換到高倍鏡（10×40）下觀察。
注意事項
影響孚爾根（Feulgen）反應的主要因素
(1)水解時間和溫度： 這是實驗的主要關鍵。水解適當時，染色體著色較深而細胞質不顯顏色，水解不足，染色體著色淺淡，細胞質中可能有其他醛基存在而顯示擴散的紅色。水解過度，則染色體著色不勻，這是由于DNA解聚而產生的游離核酸分子從染色體擴散到細胞質中，使細胞普遍著色。隨著時間的過度，會使水解液中的反應增強，而細胞不能著色。
(2)固定液的成分： 不同成分的固定液常出現不同的顏色反應。含鉻酸的固定液產生紅色，酒精-醋酸固定液產生紅色、紫紅色，只用酒精的呈現紫色，用含甲醛的固定液則呈現強烈的紫紅色。當需要對染色體中的DNA 定量測量時，一般只能用不含金屬離子和甲醛的固定液，如酒精-醋酸固定液等。
(3)SO2含量： Schiff試劑中的SO2含量也影響孚爾根反應的顏色表現。SO2含量低時呈紅色，含量高時則偏向藍色。
(4)染色質中DNA的含量： 供試材料的染色質中DNA含量的不同是影響顯色反應強度的根本因素。不同生物和不同的組織、細胞中DNA含量不同，顯色強度也各異，并且二者之間是正相關的。實踐證明，具有大、中型染色體的材料，如百合科及部分禾本科植物材料，適于用孚爾根反應，小型染色體的材料特別是玉米、水稻等不適于用孚爾根法染色。
