MALDI 質譜分子成像是在專門的質譜成像軟件控制下，使用一臺通過測定質荷比來分析生物分子的標準分子量的質譜儀來完成的。被用來研究的組織首先經過冰凍切片來獲得極薄的組織片，接著用基質封閉組織切片并將切片置入質譜儀的靶上。通過計算機屏幕觀察樣品，利用MALDI 系統的質譜成像軟件，選擇擬成像部分，首先定義圖像的尺寸，根據尺寸大小將圖像均分為若干點組成的二維點陣，來確定激光點轟擊的間距。激光束通過這個光柵圖案照射到靶盤上的組織切片，軟件控制開始采集質譜數據，在質譜儀中，激光束對組織切片進行連續的掃描，組織樣品在激光束的激發下釋放出的分子被質譜儀所鑒定從而獲得樣品上每個點的質荷比（m/ z）信息，然后將各個點的分子量信息轉化為照片上的像素點。在每個點上，所有質譜數據經平均化處理獲得一幅代表該區域內化合物分布情況的完整質譜圖。儀器逐步采集組織切片的質譜數據，最后得到具有空間信息的整套組織切片的質譜數據。這樣就可以完成對組織樣品的“分子成像”。設定m/ z 的范圍，即可確定該組織區域所含生物分子的種類，并選定峰高或者峰面積來代表生物分子的相對豐度。圖像中的彩色斑點代表化合物的定位，每個斑點顏色的深淺與激光在每一個點或像素上檢測到的信號大小相關。