實驗方法原理
實驗材料 蛋白樣品
儀器、耗材 質譜儀
實驗步驟
數據庫同樣可以檢索一個單個肽段及其碎片離子的質量。肽段質量同它的碎片離子質量一起提供了非常具有鑒別力的判斷標準，可用于在序列數據庫中檢索，包括由表達序列標簽翻譯的序列數據庫（圖 5.3) 。這一手段已被廣泛用于凝膠分離蛋白質酶水斛后產生的肽段鑒定。肽段通常用上文所述的一些方法，在質譜儀氣相中被誘導產生碎片離子，例如 PSD-MALDI-MS, 或三級四極質譜及離子阱中的 CID。在這些儀器中，肽段離子斷裂的方式具有序列特異性，主要沿肽骨架的肽鍵斷裂，見圖 5.4 所示。
如果肽離子的正電荷保留在碎片離子的 N 末端，此離子被稱為 b 系列離子，用下行數字代表這一碎片離子中的氨基酸殘基數目，從 N 末端起為1 。因此， b 離子代表 C 末端缺失， N 未端完整的碎片離子。如果電荷保留在 C 末端，離子被稱為 y 系列離子：與 b 系列離子一樣有下標數字，但從 C 末端數起）。因此 y 離子代表N末端缺失， C 末端完整的碎片離子。 CID 譜圖是由幾千種獨立的裂解過程產生數據的混合圖，即 b 系列和 y 系列離子的混合圖。譜圖中也存在一些其他離子：氨基酘側鏈 (Gln, Lys, Arg) 中性丟失氨、產生少 17個質量數的離子；筑基酸側鏈 (Ser, Thr, Asp, Glu) 中性丟失 H2O 產生少 18個質量單位的離子：以及從 b 系列離子中性丟失 co 產生少 28個質量范圍的離子，即 a 系列離子：另外，如果一個肽段離子發生多次裂解，就會產生中間碎片，包括酰基離子 (acyl, 由至少 2個氨基酸殘基組成，見圖 5.4b) 和亞氨離子（見圖 5.4c 和表 5.2), 亞氨離子代表單個氨基酸的質量，因此提供了肽段的部分氨基酸組成。井不是所有的肽鍵在 CID 條件下都具有相同的斷裂傾向，在同一張 MS/MS 譜圖中產生的碎片離子的強度也有顯著差異。
最常發生的斷裂是在脯氨酰 (prolyl) 鍵上，通常產生 CID 諸圖中的最強離子峰，另外，不穩定的脯氨酰 (prolyl) 鍵斷裂還導致產生了敕常見的中間碎片酰基離子 (acyl), 并從脯氨酸殘基延伸到 C 末端令如上所述，肽段裂解可由 PSD- MALDI- MS 產生，也可用三級四極或離子阱質譜的CID誘導產牛。這二種方法中 由 PSD-MALDl-MS 導致的裂解最不易控制，在 PSD-MALDI-MS 中僅有的可變參數是激光通量和基質。另外，在 MALDI-MS 中只產生單電荷離子，電噴霧離子化產生的雙電荷和一電荷離子相比，需要更多的能量使其斷裂。因此 PSD-MALDI-MS 的成功率很低，在很多情況下，同一樣品的 PSD 譜圖質量比 ESI儀器的 CID 分析譜圖差很多。碎片離子譜圖包含有重復的信息，例如重疊的 b 和 y 系列離子以及同一肽段的多個中間離子。這種重復使碎片離子譜成為極豐富的序列特異信息來源，但也使序列的解析更加復雜，因為通常不能直接判斷某一離子歸屬于哪一種離子系列。