4）飼養細胞（Feeder cells）的制備
在細胞融合后選擇性培養過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。
常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：
按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml
不完全培養基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養液。
1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml
HAT培養基將沉淀細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養板每孔需
2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每只小鼠可得3-5×106個細胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養細胞。也可在細胞融合前1-2天制備并培養飼養細胞，這樣使培養板孔底先鋪上一層飼養細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當于2滴），然后置37℃
6% CO2的培養箱中培養。
（5）細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養
細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。
①將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0- Ag14混合于一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。
②1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。
③在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻；置40℃水浴中預熱。
④用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。
⑤用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鐘。
⑥1000r/min 5分鐘；棄去上清。
⑦加入5ml HAT培養基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。
⑧分裝96孔細胞培養板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后將培養板置37℃，6% CO2培養箱內培養。
⑨5天后用HAT培養基換出1/2培養基。
⑩7-10天后用HT培養基換出HAT培養基；（第14天后可用普通完全培養基）。經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。
3、雜交瘤細胞篩選
雜交瘤細胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，并克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的“動力學范圍”，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基于細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。