桿狀病毒儲液制備實驗——噬斑試驗測定滴度

對數生長期單層培養的 Sf 9 細胞

桿狀病毒儲液昆蟲細胞培養液

瓊脂糖頂層覆蓋物臺盼藍頂層覆蓋物（選用）60 mm 組織培養皿27℃ 培養箱1.5 ml 帶螺口蓋的凍存管

1. 用含 10％ 胎牛血清的 TNM-FH 培養液稀釋處于對數生長期的 Sf 9 細胞至約 5 × 10⁵ 細胞/ml。在噬斑試驗之前幾小時，以兩種不同的密度（2 × 10⁶ 和 1.5 × 10⁶ 細胞/ml）將細胞種于 60 mm 組織培養皿中。對病毒儲液的每一稀釋度均設復皿（二個組織培養皿），27℃ 培養。

2. 根據病毒儲液的來源，用 TNM-FH /10％ FBS 培養液制成 5 ml 病毒儲液的系列稀釋液。

高滴度病毒儲液：10-6、10^-7、10^-8 稀釋

轉染上清（野生型病毒環狀 DNA）：10^-4、10^-5 和 10^-6 稀釋

轉染上清（野生型病毒線性化 DNA）:10^-1 和 10^-2 稀釋

單個噬斑：10^-1、10^-2 和 10^-3 稀釋

3. 用一根滅菌巴斯德吸管小心從細胞（步驟 1）中吸去培養液。每一稀釋度的病毒均加 1 ml 至各復皿中 27℃ 溫育 1 h， 加入病毒時搖動培養皿以保證病毒能均勻感染細胞。

4. 溫育 1 h 后，制備瓊脂糖頂層覆蓋物。

5. 用一根滅菌巴斯德吸管吸去病毒上清液，加入 4 ml 瓊脂糖覆蓋物。讓瓊脂糖室溫固化 10～20 min (讓凝結的水滴散去）。用 Parafilm 膜分別封住每個平皿（以防干涸），27℃ 培養 6～8 天。

6. 在噬斑形成較好而且裸眼容易看出的培養皿上，計數每一稀釋度形成的噬斑數，計算病毒滴度（pfu/ml）。在 10^-7 稀釋度的培養皿形成 10 個噬斑或在 10^-8稀釋度的培養皿形成 1 個噬斑，病毒滴度計算為 10⁸ pfu/ml。

7. 如果裸眼辨別噬斑時遇到困難，則用臺盼藍染色。制備臺盼藍覆蓋物，傾覆 1 ml 至培養了 6～8 天噬斑形成較好的培養皿中。27℃ 過夜溫育培養皿，讓染料擴散進入死細胞，計數藍色噬斑的數目并確定病毒滴度。（噬斑內的死細胞將吸收臺盼藍染料，噬斑周圍的活細胞不會吸收臺盼藍染料。）

確定病毒滴度的另一方案是終點稀釋法。采用這種方法，需制備一系列病毒稀釋液，并以此感染微量滴定板中的細胞，然后記好每一孔是否存在病毒感染并確定 50％ 終點。然而用這種方法滴定重組病毒儲液，得到的結果與噬斑試驗相比較難解釋。野生型病毒由于包含體的聚集很容易計數，而重組病毒則由于沒有包含體有時難以計數。

1. 每一稀釋度均設復皿是必需的，因為噬斑實驗的結果有差異。通常測定 3 個不同稀釋濃度的病毒所形成噬斑，共需要 12 塊組織培養皿測定每種病毒儲液的濃度（6 塊培養皿以 1.5 × 10⁶ 細胞/ml 接種，6 塊培養皿以 2 × 10⁶ 細胞/ml 接種）。

2. 做病毒噬斑試驗時，細胞單層培養物的密度很關鍵。如果培養 5 天后，噬斑仍然太小，則細胞接種太密；如果噬斑太大和擴散，則細胞接種太稀。對特定細胞系，可用一系列不同的細胞密度通過噬斑實驗確定其最佳噬斑細胞密度。

3. 如果重組病毒含有 lacZ 基因，如來自 pBlueBacIII (Invitrogen) 或 pAC360 β-Gal 的重組體，在瓊脂糖固化前加入 150 μg/ml X-gal（來自 20 mg/ml 儲存液，儲存液由無菌的二甲基甲酰胺制備， -20℃ 可保存數月），重組體的噬斑因顯示明亮的藍色容易與非重組體辨別。

4. 步驟 5 中，若使用加濕的 27℃ 培養箱，培養皿無需用 Parafilm 膜封住。

5. 噬斑持續形成至 2 周。如果在 2 周時還看不到噬斑，可能由于細胞接種密度過高所致，應該以較低密度（在 1 × 10⁵ 和 1.3 × 10⁶ 細胞/平皿之間）重新接種。