桿狀病毒昆蟲細胞表達系統

一、桿狀病毒表達載體

最簡單的經典桿狀病毒表達載體是一個重組的桿狀病毒，其基因組含有一段外源核酸序列，通常為編碼目標蛋白質的dDNA，在多角體蛋白啟動子控制下進行轉錄。這個嵌合的基因由多角體蛋白啟動子和外源蛋白編碼序列組成，其位于病毒基因組多角體座位，替代了非必需的野生型多角體基因。在實驗室中，重組病毒能夠感染昆蟲細胞或幼蟲(毛蟲），這會使外源cDNA在感染的極晚期出現高水平的轉錄。轉錄出的mRNA經翻譯產生目標蛋白質。多角體蛋白啟動子似乎總是可以在轉錄水平上驅動極高水平的外源基因表達，在很多時候可以獲得大量的外源蛋白, 就像最初推測桿狀病毒能夠制造出大量的多角體蛋白那樣。確實是這樣，具有高水平表達重組蛋白的潛能是桿狀病毒-昆蟲細胞系統的一個主要優點。在此, 高水平的含義非常寬泛，是指每升感染桿狀病毒的昆蟲細胞培養物或4 g昆蟲細胞(通常細胞密度為 1X106 個細胞/mL)產出大于或等于100 mg的重組蛋白。此外，在桿狀病毒-昆蟲細胞系統中高水平表達的蛋白質很少形成包涵體，而包涵體常常在細菌表達系統中形成。任何從事重組蛋白生產的研究人員都清楚，在任何表達系統中蛋白質可以達到的產量和可溶水平很大程度上取決于所研究的蛋白質本身。因此, 從25年的桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統使用經驗得出的結論是: 與分泌蛋白相比，該表達系統更易獲得細胞核蛋白和細胞質蛋白的高表達。前者的表達水平較后者要低, 通常只有每升幾毫克到十幾毫克 (Jarvis,1997)。

桿狀病毒-昆蟲細胞系統的另一個優點是具有真核蛋白的加工能力, 包括對蛋白質進行磷酸化或糖基化等的修飾能力。但是，這種觀點有一定的局限，現在已經很清楚地認識到，桿狀病毒的鱗翅類昆蟲細胞宿主的蛋白質加工與更高等的真核細胞不同。另外的困擾是桿狀病毒的感染對宿主蛋白質加工有負面的影響（Azzouzetal.,2000;JarvisandSummers，1989)。顯然，對于任何有興趣生產需要進行真核修飾的重組蛋白的研究者來說，特別是已知這種修飾直接或間接的影響功能，這些都是需要重點考慮的因素。

最后指出的是，桿狀病毒-昆蟲細胞系統已被證明對多蛋白質亞基復合物(multiproteinsubunitcomplexe) 的生產非常有用[參考Berger等 (2004);Kost等（2005) 的綜述]。

該系統能夠產生由多組分構成的病毒顆粒，這樣的病毒顆粒是極好的候選疫苗，這體現了該系統在此重要應用領域的強大功能。例如，桿狀病毒-昆蟲細胞系統已經用來生產由脊髓灰質炎病毒（poliovirus)、藍舌病毒（bluetonguevirus)、腺相關病毒（adeno-associatedvirus)、丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus) 和乳頭瘤病毒（papillomavirus)來源的多種蛋白質組成的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒的產生可以通過構建多個表達單一蛋白質的重組病毒來實現，或者構建一個能夠編碼多個重組蛋白的單一病毒去感染昆蟲細胞。

二、桿狀病毒表達載體技術一早期

如前所述，利用基本的同源重組原理，構建了第一個重組的桿狀病毒載體用于表達由多角體蛋白啟動子和外源編碼序列組成的嵌合基因。該方法的詳細技術可以參考本書的第一版(Bradley,1990), 也可以參考原作者發表的主要論文及其編寫的優秀的技術手冊(O’reillyetal.，1992;SummersandSmith，1987)。因此，和上面一’樣，這部分在此不再贊述。但是，為了對背景有所了解, 對此進行簡短地介紹還是很重要的。該常用的方法涉及:

①構建具有嵌合基因的細菌轉移質粒，該嵌合基因具有來源于病毒基因組多角體區域的側翼序列（圖I4.1);

②使用轉移質粒與從純化的野生型AcMNPV提取的基因組 DNA 的混合物共轉染培養的昆蟲細胞（圖14.2)。

在共轉染的昆蟲細胞中，轉移質粒與AcMNPV基因組通過同源重組產生重組病毒 DNA 分子，該同源重組發生在轉移質粒上的目的嵌合基因側翼序列與病毒基因組多角體蛋白基因的上游和下游序列之間。為了在敲除(knockout)多角體蛋白基因的同時敲人(knock-in) 編碼目標蛋白質的嵌合基因，這必須是一個發生了雙交換的重組(doublecrossoverrecombination)。當然，這種重組的發生率相對較低，估計在 0.1% 左右(Smithetal.，1983a)。因此, 必須將少數重組病毒的子代病毒從共轉染產生的大量的親代病毒的子代病毒中分離出來. 通過桿狀病毒空斑實驗可以很容易地完成分離, 但是研究人員要能夠從大量的親代病毒產生的空斑中辨別出重組病毒形成的空斑。最初，可以通過簡單的肉眼篩選來進行辨別, 因為來自親本的子代病毒形成的為多角體蛋白陽性的空斑, 而重組體子代病毒由于缺少表達多角體蛋白的基因，所以呈現多角體蛋白陰性的空斑。經過專業培訓的研究人員能夠在解剖顯微鏡下通過觀察實驗平板鑒定出多角體蛋白陰性的空斑。因此, 有這種辨別能力是篩選成功的關鍵。多年來，許多研究人員不具有識別多角體蛋白陰性的桿狀病毒空斑的能力，這是一個非常嚴重的問題，它制約著桿狀病毒-昆蟲細胞系統作為表達重組蛋白生產工具的應用。

三、桿狀病毒表達載體技術—-改進

從1卯0年左右開始，研究人員開始克服了桿狀病毒載體分離方面的技術局限，并且通過對上述基本方法的大量改動，在別的方面對該系統也進行了改進。這些改進可以分為兩類: 一類是轉移質粒的改進; 另一類是親代桿狀病毒基因組的改進。下面對它們分別進行介紹。

四、桿狀病毒轉移質粒的改進

對轉移質粒進行了改進是出于兩個不同的目的。最重要的目的是使通過肉眼篩選鑒定重組桿狀病毒空斑變得簡單，從上面描述的原因可知這曾經很難。通常的一種此類改進方法是引人在桿狀病毒啟動子控制下的嵌合標記基因。例如，大腸桿菌的/3-半乳糖苷酶蛋白與多角體陰性空斑表型相比，對它的肉眼識別更加容易（Vialardetal.，1990)。

在轉移質粒中引人標記基因是聰明的做法，但也應該注意到該種改進方法存在的潛在問題（O’reillyetal.，1992)。弓丨人的標記基因不僅能夠作為所需要的雙交換同源重組的信號，也能夠作為在轉移質粒和病毒 DNA之間產生的單交換同源重組(singlecrossoverrecombination) 的信號。單交換重組的發生概率很高，所產生的重組病毒的基因組包含了細菌復制子在內的轉移質粒的全部序列，而且整合位點有一定的隨機性。這些重組體在遺傳上是不穩定的, 新獲得的外源基因可能會在 1~2輪的病毒復制中丟失。盡管有很大的局限性, 能將標記基因引入重組病毒基因組的轉移質粒還是被廣泛使用, 對于那些清楚知道潛在的單交換重組陷阱的研究人員來說, 它們尤其有用。他們只是使用標記基因進行初篩, 然后通過進一步篩選來確定外源基因在基因組中的整合位點，最后確定是否是雙交換重組將目的基因轉移到了重組桿狀病毒載體。

對轉移質粒進行改進的第二個目的是方便重組蛋白在桿狀病毒-昆蟲細胞系統的表達與純化。這種改進的數量太多因而不能在此逐一討論, 有3 種通常的改進屬于此類，它們包括引人信號肽的編碼序列; 在蛋白質的N端或C端引入純化標簽的序列（如His6); 將多角體蛋白啟動子替換為別的桿狀病毒啟動子, 或者使用多個啟動子元件替換多角體蛋白啟動子，這樣就可以在桿狀病毒感染時同時表達多個重組體蛋白。

最近的一個出版物列出了幾乎所有的經過上述兩類改進的桿狀病毒轉移質粒，并且簡短描述了它們功能上的特色，它是該領域一個很好的信息來源（PosseeandKing,2007)。但是，有一類改進并未列出但值得進一步的關注，它們是即刻早期（immediate^early)轉移質粒，在這些質粒中，多角體啟動子被替換為桿狀病毒即刻早期基因的啟動子，如AcMNPV的iel基因 (Jarvisetal.，1996)。使用來自桿狀病毒早期基因的啟動子 (如iel基因)似乎違反之前提及的原則，因為這些啟動子比多角體蛋白啟動子弱。但是，有一些證據可以表明，在早期啟動子控制下重組桿狀病毒表達外源基因可以獲得更高質量的蛋白質產物，盡管這些早期啟動子不能啟動同樣高水平的轉錄（ChazenbalkandRapoport,1995；Hill-PerkinsandPossee,1990；Jarvisetal.,1996；Murphyetal.,1990;Rankletal.，1994;SridharetaUW93)。事實上，這個方法尤其適用于分泌蛋白。如上所述，這些蛋白質在多角體蛋白啟動子控制下通常是低水平的表達。在這種情況下, 研究人員或許能夠利用這種在感染較早期進行外源基因表達的好處, 從而避免桿狀病毒感染對宿主蛋白加工途徑帶來的負面作用，同時也能夠獲得高水平表達的產物。