桿狀病毒系統蛋白質表達實驗——蛋白質生產高峰期的確定

因為重組蛋白的表達受多角體啟動子的調節，而多角體啟動子在病毒裂解循環的晚期才被激活，所以重組蛋白在感染后期才表達。重組蛋白通常在感染后 15～24 h之間即可檢測到，并可積累至感染后 40 h 左右，然后積累水平下降。由于不同的蛋白質在昆蟲細胞中有不同的穩定性，推薦用這個系統測定蛋白質積累的時間效應。

野生型桿狀病毒草地夜蛾（Sf 9）細胞高滴度重組桿狀病毒儲液

PBS1 × SDS 樣品緩沖液10% 胎牛血清

TNM-FH昆蟲培養基60 mm 組織培養皿27℃ 培養箱（濕度可選）15 ml 聚丙烯離心管Beckman GPR 離心機沸水浴／100℃加熱板超聲儀

1. 分別接種 3 × 10⁵ 細胞于 15 個盛有 3 ml 含 10% 胎牛血清的 TNM-FH 培養基的 60 mm 組織培養皿中。27℃ 溫育 1 h，使細胞貼壁。然后每次均以感染復數（MOI）為 10 的量，用野生型病毒感染 7 個培養皿，用重組病毒感染 7 個培養皿，剩余的一個培養皿為非感染對照。

另外，也可用 3 個 100 ml 旋轉培養瓶懸浮培養 Sf 9 細胞。當細胞達到 1.5 × 10⁶ 細胞/ml的密度時，一個以重組病毒感染，另一個用野生型病毒感染，感染復數為1～2，剩下的一個作為非感染培養物對照。

2. 在感染后的不同時間（從感染后約 15～72 h）收獲細胞，感染后 15 h 收獲非感染細胞：將細胞和培養物上清轉移至離心管，4℃ 1000 g 離心 10 min，收獲細胞。

3. 按照基本方案 1，處理并分析細胞（非分泌型重組蛋白）或上清（分泌型重組蛋白)。

如果細胞懸浮培養，則在每一時間點取出 2 ml 的小份培養物，采用與單層培養同樣的方法處理細胞和上清液。