【實驗目的】
掌握T克隆的原理和方法。
了解質粒提取的原理和方法。
【實驗原理】
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA 連接酶的作用下，有Mg2+
、ATP存在的連接緩沖系統中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq
DNA聚合酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-T Vector
末端游離的T堿基互補形成環狀重組T質粒。將攜帶目的基因的T質粒轉入大腸桿菌并對其進行藍白斑篩選鑒定，挑選出所需的重組質粒。
【實驗器材】
F 試劑耗材：Taq
DNA聚合酶、安芐青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T載體、LB培養基、培養皿、涂玻棒、移液槍、槍頭、1.5ml離心管、PCR
管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、無水乙醇、RNAase A、DNA Marker。
F 儀器：PCR儀、恒溫培養箱、恒溫搖床、恒溫水浴鍋、離心機、無菌操作臺。
【方法步驟】
（一） 引物設計
從NCBI上下載果蠅的白眼突變基因序列（GenBank登錄號：X51749），依照此序列用Primer 5.0軟件分別設計上游和下游擴增引物。
（二） 目的基因片段的PCR擴增
25μl反應體系：
模板cDNA 1.5μl
10×reaction buffer 2.5μl
2.5mM MgCl2 2μl
2.5mM dNTP 2μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl
加ddH2O至總體積 25μl
按照以下程序進行PCR擴增：
94℃預變性4min；
94℃變性40s，55℃退火40s，72℃ 延伸1min，共30個循環；
72℃總延伸10min，4℃保存。
取5μl PCR產物與熒光染料混合均勻在1%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE電泳緩沖液、100V恒壓)，用凝膠成像系統照相觀察，確定所得DNA片段的大小和純度。
（三）目的基因片段PCR產物的純化回收
將PCR產物與熒光染料混合均勻進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下用干凈刀片切下含目的基因片段的膠帶。按照北京鼎國生物技術有限公司生產的DNA快速純化/回收試劑盒操作說明，純化回收目的片段。
（四）目的基因片段與克隆載體的連接
PCR產物經試劑盒純化回收后，通過T/A克隆的方法，直接與pMD18-T載體連接，連接反應體系如下：
純化回收的PCR產物 4μl
Ligation SolutionⅠ 5μl
pMD18-T Vector DNA 1μl
混勻后16℃連接過夜。產物可于-20℃保存。
（五）連接產物的轉化
(1) 取出-80℃保存的制備好的感受態細胞，冰上放置10～20min融化；
(2) 加入5μl連接產物，輕輕混勻后冰上放置30～40min；
(3) 42℃水浴中熱擊90s，輕輕放回冰上冷卻2min；
(4) 加入880μl LB液體培養基(不含氨芐青霉素)和20μl葡萄糖，37℃搖蕩培養1h；
(5) 制備X-gal平板：取40μl X-gal、 4μl IPTG和56μl滅菌雙蒸水混勻后均勻地涂布于含100μg/μl氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，放置1h以充分吸收；
(6) 取適量的菌液(200μl)，涂布于X-gal平板上，37℃培養1h后，倒置培養14～16h。
（六）重組質粒的篩選
分別挑取白色和藍色單菌落于5ml LB液體培養基中(含100μg/μl 氨芐青霉素)，37℃振蕩過夜培養，用堿裂解法抽提質粒DNA。步驟如下：
(1) 取適量菌液于1.5 ml的離心管中，瞬時離心，倒掉培養基，盡可能倒干凈；
(2) 加溶液I 100μl，渦旋重新懸浮沉淀；
(3) 加溶液II 200μl，輕輕搖勻，在冰上放置3～5min使大腸桿菌裂解，釋放質粒DNA；
(4) 加預冷的溶液III 150μl，輕輕顛倒搖勻，出現白色絮狀沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反應；
(5) 4℃，12000rpm離心8min，轉移上清至1.5ml離心管；
(6) 以體積比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，輕輕搖勻，靜置2分鐘；
(7) 4℃，12000rpm離心10min，轉移上清至1.5ml離心管；
(8) 加入400μl三氯甲烷搖勻， 4℃，12000rpm離心5min；
(9) 取上清加2倍體積預冷的無水乙醇，4℃，12000rpm離心8min；
(10) 棄上清液,加75%乙醇1000μl洗滌2次，放置干燥；
(11) 加50μl 雙蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保溫2h，電泳檢測(電泳中以藍斑質粒DNA為對照，出現滯后帶的確認為重組質粒)后-20℃保存備用。
(七) 重組質粒的測序驗證
將提取純化后的質粒送至上海生物工程公司進行測序得到克隆基因的堿基序列，分析驗證克隆的目的基因的正確性。
【實驗結果】
2. 目的基因的PCR電泳結果。
3. 質粒電泳結果。
4. 測序驗證結果。
【實驗思考】
1. 目的基因片段與克隆載體連接過程中的注意事項。
2. 影響感受態細胞轉化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項。
3. 簡述熱激法轉化和藍白篩選的原理。
4. 簡述堿裂解法提取質粒的原理以及各試劑的作用。
【參考文獻】
1. J.薩姆布魯克， D.W 拉塞爾. 《分子克隆實驗指南》（第三版），科學出版社，2002.
2. Pepling M, Mount S M. Sequence of a