1. eccDNA成環的整體統eccDNA測序結果充分體現了基因組水平成環的多樣性。eccDNA來源十分豐富，同一個基因有可能會產生非常多的環狀，同樣一個環狀也不僅僅只會包含一個外顯子。TTN基因就是一個非常典型的例子。該基因長度達到了0.3Mb，而這樣一個基因竟然能衍生得到130個eccDNA，是一個經典的編碼基因區域成環的案例。其中比較有代表性的是43-66以及44-52號外顯子所組成的環狀分子。eccDNA測序的目的正是在組學的層面上全面的描述刻畫eccDNA的成環多種可能性。
圖1 來源于TNN基因的兩例eccDNA
2.eccDNA長度分布與來源探索
eccDNA是環狀結構，這樣一種分子的長度分布如何？測序結果顯示99%的eccDNA長度小于25Kb，其中僅有占比約1%的分子大于25Kb。在這99% 當中，在0.1Kb以及5Kb處有富集峰，這表明該區段的eccDNA占絕大多數。經典的知識體系告訴我們重復序列以及5sRNA部分最容易成環，事實上測序結果也充分證明這一點，SINE（3.1%）、LINE（3.5%），中心粒（2.0%），以及sRNA（8.1%）部分是最經典的成環結構，大量的環能夠匹配到這些區域。
圖2 eccDNA長度分布和來源多樣性
3.eccDNA基因組分布
前文提到99% eccDNA小于25Kb，作者分別探索這些eccDNA來源于哪些染色體。結果顯示所有染色體對eccDNA都有所貢獻。其中小于25Kb部分的環狀在染色體上的分布相對密集。
圖3 eccDNA的染色體分布
4. eccDNA形成的基因偏好性
既然每一條染色體都有可能成環，都對eccDNA多樣性產生巨大貢獻，那eccDNA產生是否有一定的偏好性呢？文章測序結果顯示17和19號染色體成環的可能性最大，由于17號染色體有相對多的編碼基因，研究者猜測成環的可能性可能與編碼基因數目呈正相關。
圖4 17號與19號染色體對eccDNA貢獻最大
5. eccDNA具有轉錄活性
eccDNA能夠高效擴增成環序列，這種擴增是否有轉錄活性？RNA轉錄本是否僅僅來源于傳統線性的染色體？要回答這一問題，作者通過RNA-seq（云序提供該服務）進行探索，結果發現split-reads，即在RNA-seq測序的結果當中同樣發現了能夠跨過相同剪切位點的測序片段，這種片段的剪切位點和eccDNA成環的剪切位點序列保持一致，說明環形的eccDNA也具有轉錄活性，這一點非常重要，這很有可能造成成環基因（尤其原癌基因和耐藥基因）在轉錄本水平的明顯高表達從而進一步促進癌癥的發生發展，是非常具有臨床意義的研究成果。
圖5 HIP1形成eccDNA具有轉錄活性
6. eccDNA成環驗證
類比于經典的circRNA，eccDNA的形成具有相似性，也是經過核酸序列的反式鏈接得到的產物。當然有關于成環機制的問題依然還需要大量的研究討論。不過對于環狀的結構驗證可以模仿circRNA，針對junction site，就是鏈接位點設計發散引物（divergent primer）同時設計收斂引物（convergent primer）進行PCR擴增，然后通過Sanger測序的方式驗證eccDNA的接頭序列。
圖6 eccDNA的驗證
總結
從eccDNA全新視角理解生物過程的發生發展，這篇Nature Communication文章提供了最好的參照。研究者在進行eccDNA-seq之后對高通量數據進行整理歸納，從eccDNA的個數、長度、來源、分布和基因相關性進行深入分析，造就一篇10分以上“表達譜”的文章。這將會是一個契機，通過快速的eccDNA-seq結合PCR方式率先用“譜”的方式快速闡述一個疾病當中哪些基因易于成環、哪些基因擴增效率更高并快速和疾病的發生發展建立聯系，有理由相信這種雖然簡單但是高度創新的文章一定會備受矚目，影響因子再創新高。
eccDNA以顛覆傳統認知的方式重新走到科研舞臺的中心，必將在未來的一段時間掀起一場有關基因擴增、轉錄的大討論。我們已經習慣了觀察基因的缺失、突變、插入和移位，eccDNA的產生從新的角度讓科研工作者去思考基因組存在的動態性和多樣性。由此，腫瘤的異質性、腫瘤微環境、液體活檢和耐藥性等相關研究必定會圍繞eccDNA展開更多集中式的研究和探索，有理由相信這次2019年年末的Nature和Cell文章的發表將成為里程碑式的作品，引領未來三到五年內有關eccDNA研究的新方向。