標記抗體的應用技術——化學發光免疫分析

　　　　　　　　HRP

luminol＋H₂O₂───→產物＋hν

　　　　　　　  產　物
                                ↑　　　　　　　　　　　　　　　　
Eosin＋H₂O₂ ────┘
                     　HRP

血清中HBsAg含量越高，結合的酶標抗體越多,則偶合放大化學發光強度越強；反之亦然。因此，可以根據檢測到的化學發光光強度來間接定量人血清中HBsAg的水平。

抗體抗原血清

NaHCO3緩沖液抗體稀釋液

加樣器試管聚苯乙烯珠洗瓶、抽濾裝置

1.  包被抗體　

在每個小試管中加入聚苯乙烯珠各一枚，再加入300 μl用0.05 M，PH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋的抗HBsAg抗體，同時設空白對照，置4 ℃過夜。

　　
2.  洗滌　

用抽濾針頭吸干管內液體，加入Tris-HCl-Tween20洗滌3 次，每次加2 ml，放置3～5 min，用抽濾針頭吸干管內液體。

　　
3.  加待檢血清和陽性標準品　

用PBS-Tween20緩沖液不同倍數稀釋HBsAg陽性標準品或待檢血清，每管加入300 μl。同時設陰性對照，空白對照管只加抗體稀釋液。置37 ℃孵育2 h。

　　
4.  洗滌　

同2。

　　
5.  加酶標抗體　

用含小牛血清的PBS-Tween20緩沖液稀釋HRP標記的抗HBsAg抗體，每管加入300 μl，空白對照管只加用于稀釋酶標抗體的稀釋液。置37 ℃孵育2 h。

　　
6.  洗滌　

同2。

　
7.  化學發光測定　

給每管加入300 μl底物溶液，置37 ℃保溫20 min。然后將小試放入LKB-1250 lumimeter中，并置于測量位置，加入300 μl 5.0×10－4 M luminol。記錄儀記錄化學發光強度。

　　
8.  同時用ELISA方法進行對照，結果測量采用DG3022型酶聯免疫檢測儀。

1.  洗滌要徹底，以免因血清中其他來源的過氧化物酶類物質所產生的非特異性反應，而影響測定結果。

　　
2.  實驗中，應分別設置陽性、陰性、空白對照來控制實驗條件，且每份樣品均應做三個復管，以保證實驗結果的準確性。

　　
3.  為了克服酶標抗體因非特異性吸附而造成的較高本底，可用適量小牛血清加以抑制。

　
4.  當加入luminol后，迅速產生化學發光并使發光在一秒鐘內達到峰值，然后很快衰減到基線水平。因此，只有當小試管置于儀器的測量位置時，方可加入luminol。

　　
5.  底物的加入，是為了增強化學發光強度。但只有當底物分子與酶催化活性中心充分接觸時，反應速度才能加快。當反應進行15 min達到平衡時，牷學發光強度則不再隨時間的延長而變化，且在1 h內保持穩定，因此，控制底物與酶反應15 min后加luminol進行化學發光測定。

一、結果判定

1.  定性　

按下列公式判別陰、陽性

　　　L樣品－L空白　　      ┌≥2.1　為陽性

S/N ＝ ────────　＝　商│

　     L陰性對照－L空白   　 └＜2.1　為陰性

　　
2.  定量　

以不同稀釋度的HBsAg陽性標準品的化學發光強度為縱坐標，不同稀釋倍數為橫坐標，作出劑量反應曲線（標準曲線），待測樣品中HBsAg的含量就可由測量的化學發光強度換算得到。