核糖核酸酶保護(用核糖核酸酶和放射性標記的RNA探針對RNA作圖)
實驗方法原理 核糖核酸酶保護分析用于度量特異性 mRNA 的豐度以及為它們的拓撲異構特征作圖。這種方法包括測試 RNA 與互補的放射標記的 RNA 探針（核糖探針）雜交，然后未雜交的序列被一種或幾種單鏈特異性的核糖核酸酶裂解。
實驗材料 RNA 聚合酶DNase I 蛋白酶 KRNA 酶抑制劑RNA 酶消化混合液載體 RNA核糖核苷酸標準 RNA待測 RNAUTP核糖核酸探針
試劑、試劑盒 乙酸銨DTT雜交緩沖液苯酚氯仿RNA 凝膠加樣緩沖液SDS乙酸鈉TE轉錄緩沖液三氯乙酸聚合酶稀釋緩沖液
儀器、耗材 變性的聚丙烯酰胺凝膠水浴Whatman 3 MM 濾紙或類似物
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
乙酸銨（10 mol/L）
DTT ( 0.2 mol/L)
雜交緩沖液（用于 RNA)（40 mmol/L PIPES (pH 6.8)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.4 mol/L NaCl，80% 去離子甲酰胺，使用 PIPES 的二鈉鹽，用 1 mol/L 的鹽酸調節 pH。）
苯酚：氯仿（1:1，V/V）
RNA 凝膠加樣緩沖液（95% 去離子甲酰胺，0.025% （m/V）溴酚藍，0.025% （m/V）二甲苯腈藍 FF，5 mmol/L EDTA（pH 8.0），0.025% （m/V）SDS）
SDS ( 10% m/V)
乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)
TE ( pH 7.6)
10X 轉錄緩沖液（0.4 mol/L Tris-Cl( pH 7.5 )，0.1 mol/L NaCl，60 mmol/L MgCI2，20 mmol/L 亞精胺，-20℃ 分裝保存）
三氯乙酸（1% 和 10% TCA)
2. 酶和緩沖液
噬菌體編碼的依賴 DNA 的 RNA 聚合酶
DNase I ( 1 mg/ml，無 RNase 的胰 DNase)
聚合酶稀釋緩沖液
蛋白酶 K ( 10 mg/ml)
RNA 酶抑制劑，置冰上
RNA 酶消化混合液（300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.4)，5 mmol/L EDTA（pH 7.5)，40 μg/ml RNase A，2 μg/ml RNase T1，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制備 10 mg/ml RNase A (小牛胰 RNaae)，用 10 mmol/L Tris-Cl ( pH 7.5 )，15 mmol/L NaCl 制備 1 mg/ml RNase T1，凝膠）
變性的聚丙烯酰胺凝膠（含 8 mol/L 尿素）
3. 核酸和寡核苷酸
載體 RNA (1 mg/ml）
用于模板制備的質粒 DNA 或線性靶 DNA
核糖核苷酸
標準 RNA
待測 RNA
UTP (100 μmol/L)
4. 探針
核糖核酸探針
5. 放射活性成分
[α-32P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）
6. 專用設備
預置到 30℃，85℃，95℃ 和合適復性溫度的水浴
Whatman 3 MM 濾紙或類似物
二、方法
制備隨機標記的單鏈 RNA 探針
1. 制備線性 DNA 模板
(1) 從質粒 DNA 制備模板
① 用 5 倍過量的適當的限制性內切核酸酶切割克隆的 DNA 序列內部或下游使 5~20 μg 質粒線性化。線性化后形成的末端與啟動子距離應為 200~400 bp。確保所使用的限制酶不直接使啟動子與目的序列分離。因為噬菌體編碼的 RNA 聚合酶需 3' 末端起始轉錄，所以選擇能產生平末端或 5' 突出端的限制酶。
② 消化反應后，取少量反應液用瓊脂糖凝膠電泳分析。確保無痕量的環狀質粒可見，否則，加入適量的酶繼續消化直到檢測不到環狀質粒為止。
③ 酚：氯仿抽提兩次純化線形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗滌，pH7.6 的 TE 溶液溶解，濃度為 1 μg/μl。
(2) 靶 DNA 擴增制備模板
① 用 PCR 擴增長度為 100~400 bp 的雙鏈 DNA 模板（Schowalter and Sommer 1989; Bales et al.1993; Davis et al. 1997)。
② 瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 PCR 擴增產物以確保片段大小正確。
③ 酚：氯仿抽提兩次純化線形 DNA，再利用乙醇沉淀。沉淀用 70% 乙醇洗滌， pH 7.6 的 TE 溶液溶解，濃度為 1 μg/μl。
2. 按順序混合下列溶液，除特殊說明的預熱至室溫。
0.5 μg 線性的 DNA 模板
1 μl 0.2 mol/L DTT
2 μl 核酸溶液
1 μl 100 μmol/L UTP
50~100 μCi [α-32P] UTP（10 mCi/ml，800 Ci/mmol）
補水至 16 μl
2 μl 10X 轉錄緩沖液
24 單位 RNA 酶抑制劑（冰上）
15~20 單位噬菌體 RNA 聚合酶（冰上）
室溫下按順序加入上述試劑既可防止 DNA 被轉錄緩沖液中的亞精胺和 Mg2+ 沉淀，又可防止 RNA 酶抑制劑被高濃度的 DTT 失活。
將上述混合液 37℃ 保溫 60 min。
3. 上述反應結束時，加入 1 單位不含 RNA 酶的 DNA 酶約 1 μg，繼續 37℃ 保溫 10 min。
4. 用 TE 緩沖液（pH 7.6) 稀釋反應液至 100 μl，取 1 μl 測量總放射活性和可被 TCA 沉淀的放射活性。通過摻入的可被 TCA 沉淀物質的放射活性比例，計算反應合成的 RNA 探針重量和特異性活性。
5. 第 4 步溶液移取 1 μl 后，在剩余稀釋反應液中加入 10 μl 1 mg/ml 載體 RNA。酚: 氯仿抽提反應液，將水相移至一新管，加入 10 μl 10 mol/L 乙酸銨 300 μl 乙醇沉淀 RNA。貯存于 -20℃ 直到第 4 步完成。
6. 4℃ 高速離心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗滌，再次離心。棄上清，室溫干燥 RNA 直到無痕量乙醇可見。若探針需凝膠電泳進一步純化（步驟7），則用 20 μl 膠加樣緩沖液稀釋沉淀的 RNA，否則，用 20 μl TE 緩沖液（pH 7.6 ) 稀釋沉淀的 RNA。
7. 用預先準備的含有 8 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化探針。高特異性活性的探針應在近期使用，以避免 RNA 的放射化學損傷。
8. 將待測的每種 RNA 和標準 RNA 核酸探針合并（2X105~10X105 cpm，0.1~0.5 ng) 。加入 0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鈉 (pH 5.2）和 2.5 倍體積冰乙醇。將混合物貯存于 -20℃ 10 min，4℃ 高速離心 10 min 回收 RNA。75% 乙醇洗滌沉淀。小心棄去乙醇，室溫干燥沉淀直到乙醇完全蒸發。
9. 用 30 μl 雜交緩沖液溶解 RNA。多次上下吹打溶液以保證沉淀徹底溶解。
10. 雜交混合液在 85℃ 保溫 10 min 使 RNA 變性，然后迅速將其轉移至設置在復性溫度的保溫器后或水浴中，保溫 8~12 h。
11. 將雜交混合液冷卻到室溫，加入 300 μl RNA 酶消化混和液，30℃ 消化 60 min。
12. 加入 20 μl 10% SDS 和 10 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K 終止反應。反應混合液 37℃ 保溫 30 min。
13. 加入 400 μl 酚: 氯仿，劇烈震蕩 30 s, 室溫離心 5 min 分相。
14. 將上相移至新管，小心避免接觸兩相中間界面。
15. 加入 20 μg 載體 RNA 和 750 μl 冰乙醇。將溶液混合并 -20℃ 放置 30 min。
16. 4℃ 高速離心 15 min 回收 RNA。小心棄去乙醇，用 500 μl 170% 乙醇洗滌沉淀。再次離心。
17. 小心棄去乙醇，室溫干燥直到痕量乙醇蒸發。
凝膠電泳分析抗 RNA 酶的雜交體
18. 用 10 μl 凝膠加樣緩沖液重懸沉淀。
19. 95℃ 加熱核酸 5 min，迅速置冰上。短暫離心使樣品收集在管底。
20. 利用含 8 moI/L 尿素的聚丙烯酰胺薄膠電泳分析標記的核酸。
21. 當示蹤染料在膠中遷移至合適距離后，關掉電源，拆除電泳裝置。輕輕撬開大玻璃板一角，慢慢從膠上移開大玻璃板。切掉膠的一角以辨別方向。
22. 將帶有膠的玻璃板移到裝有過量的 10% TCA 的托盤中。輕輕在室溫下搖動或旋轉托盤 10 min。
23. 倒掉 10% TCA 溶液并代之以過量的 1% TCA。輕輕在室溫下搖動或旋轉托盤 5 min。
24. 倒掉 1% TCA 溶液，用蒸餾的去離子水淋洗固定過的膠。將玻璃板連同膠從托盤中取出放于平板上。用紙從膠邊緣吸走多余的水分。
25. 割取一張比膠邊緣大 1 cm 的 30 MM 濾紙，將其置于膠上，將玻璃板倒轉。
26. 拿開玻璃板，將膠放到凝膠干燥器中 60℃ 干燥 1~1.5 h。
27. 建立膠的自顯影影像。通過密度計量學或磷光攝影掃描，也可以切下膠中含有相應片段的部分，利用液閃儀計數。