一、材料與設備
1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。
2. 放射自顯影用具。
3. 水浴。
4. 終止緩沖液：90% 去離子甲酰胺，0.02% 溴酚藍，15 mmol/L EDTA，50 mmmol/L HEPES-NaOH (pH 7.5)，0.1 mmol/L EDTA，12 mmol/L MgCl2。
二、操作方法
1. 發夾型核酶的結構
發夾型核酶剪切與連接活性的基本結構是核酶中區域 A 和 區域 B 的直接相互作用，每個區域主要由進化上保守的內環與兩側的短雙鏈螺旋構成。核酶的基本結構及其切割位點如圖。
現在的研究所發現的具有催化活性的發夾型核酶最小的基序為 50 nt，因此可以用固相合成的方法獲得發夾型核酶，也可以將修飾的 rNTP 導入核酶以增加其穩定性。
2. 催化反應實驗
(1) 反式剪切實驗。剪切反應可以從加入特異的陽離子形成底物-核酶復合體開始并從加入變性劑終止反應而結束；也可以通過把底物加入核酶中來啟動反應，此時所有 RNA 均先在折疊終離了濃度下預孵育。
典型的剪切反應步驟如下：
① 準備 RNA 溶液。終濃度分別為核酶 0.5 μmol/L、32P 標記的底物 RNA (1~2 nmol/L)，50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、0.1 mmol/L EDTA。
② 準備陽離子溶液。終濃度分別為 50 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.5、12 mmol/L MgCl2。
③ 上述兩種溶液先在 25℃ 平衡 5 min，再將兩溶液各取 40 μl 混合以啟動反應。
④ 在 7~12 h 每個時間點取出 3 μl，加入 10 μl 終止緩沖液在冰浴中終止反應。
⑤ 20% PAGE-8 mol/L 尿素膠電泳，放射自顯影。
(2) 連接實驗。發夾型核酶可以連接帶有 5'-OH 和 2'，3'-環化磷酸末端的 RNA。帶有 5'-OH 未端的 RNA 可以由化學合成或通過轉錄產物的去磷酸化得到。而帶有 2'，3'-環化磷酸未端的 RNA 僅能通過對發夾型核酶切割的底物跑膠分離后再切膠回收而得到。
連接實驗方法與剪切實驗方法一致，需要注意的是要保證核酶被剪切產物所飽和。 | 