核酶實驗

ATP T4多核苷酸激酶 RNasin DTT

CMCT 緩沖液 甲酰胺上樣緩沖液 終止緩沖液 Tris-HCl

低溫高速離心機 聚丙烯酰胺電泳裝置 放射自顯影用具 水浴

一、材料與設備

所有試劑及容器需紿去 RNase 處理。

1. 主要設備：低溫高速離心機、聚丙烯酰胺電泳裝置、放射自顯影用具、水浴等。

2. CMCT，I-cyclohexyI-( 2-morphohnoethyI) carbodiimide metho-p-tohicne sulfon- ate ( Sigma，St. Louis，MO )。

3. 緩沖液 A：14 mmol/L Tris-HCl (pH 7.3)，70 mmol/L KCl，0.14 mmol/L EDTA。

4. 緩沖液 B：6.25 mmol/L dNTPs、250 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl₂，15 mmol/L DTT。

5. 甲酰胺上樣緩沖液：98% 去離子甲酰胺，0.025% 溴酚藍，10 mmol/L EDTA。

6. 終止緩沖液：90% 去離子甲酰胺，0.025% 溴酚藍，5 mmol/L EDTA。

7. 400 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 。

8. [ γ-³²P] ATP。

9. T4 多核苷酸激酶。

10. 10 mol/L NH₄Ac。

11. RNasin。

12. 0.1 mol/L DTT。

13. 200 mmoI/L MgCl₂。

二、操作方法

1. 錘頭型核酶的設計及其靶位點的選擇

(1) 核酶催化核心的設計。最常用的錘頭型核酶的催化核心如圖所示。



研究發現，N₂ 替換為嘧啶核苷酸類似物可以提高核酶的剪切效率；最近還發現，在保守的 A₉ 與 G10.1 之間加入一個額外的堿基U₁₀ 以后，不僅可以保留活性，使剪切效率提高 3~4 倍，并且不影響 K_m 值。

另有一種微型核酶，它的結構與錘頭型核酶相似，其莖-II 部分被僅含一個單 G-C 堿基對的接頭所取代。這種微型核酶的活性依賴于接頭的組成，因此通過合理選擇接頭就可獲得低 Mg²⁺ 濃度條件下仍具有高度活性的微型核酶，而且它能比全長錘頭型核酶更有效地對長鏈 mRNA 進行剪切。由于生理條件下的 Mg²⁺ 濃度通常比一般核酶反應的 Mg²⁺ 濃度要低，因而微型核酶在細胞內具有更大的應用價值

(2) 核酶結合酶的設計。核酶結合臂的長度及其堿基組成對核酶活性有重要影響。由于核酶需循環使用，因此核酶與特異性位點的高效結合以及從底物 RNA 中快速有效地脫離都是非常重要的。這就要求結合臂的長度必須在保證對底物的特異性(或穩定性) 和允許產物有效解離兩個方面取得最佳平衡。對于人類基因組而言，要特異性識別一個基因的最小 ODN 長度在 12~15 bp 之間，故在保證結合特異性的基礎上應選擇長度最小的序列。也有學者提出，不等長的結合臂比等長的結合臂更有效率。

(3) 目標剪切位點的選擇。野生型靶位點：當以核酶作為研究基因功能的工具時，我 們可以選擇靶 mRNA 上的最佳切割位點，因此，潛在的靶位點應選擇 GUCUU 或 GUCUA，在體外證實，其切割效率比僅是 UH 的位點更高。

突變位點的選擇：當基因突變產生新的 UH 位點時，可以比較成功地把錘頭型核酶設計為特異識別突變 mRNA 的形式，因為該突變位點通常位于 mRNA 的可接近區域；若突變并未產生剪切位點但點突變位于周圍僅 4 個核苷酸的范圍內時，也可以通過改變結合臂的長度和序列來設計特異識別突變位點的錘頭型核酶。

2. 確定核酶與靶位點的可接近性

選擇了靶位點以后，最重要的方面是確定該位點的可接近性。因為體內 RNA 轉錄產物都具有復雜的二級和三級結構，所以必須選擇位于 RNA 中可接近區域的靶序列而不能在穩定的高級結構內尋找靶序列。

(1) 對靶 mRNA 二級結構的預測

利用在線的二級結構預測工具 Mfold (http://bioinfo. math. rpi. edu/~Mfold/rna/forml.dgi) 對以靶序列的 13 個堿基為中心的 200~400 個堿基組成的 RNA 進行結構預測。根據預測結果排除位于穩定莖環結構中的靶位點序列，但若靶位點位于莖結構的末 端，以及部分或全部靶位點序列位于環結構中則是可以接受的。

(2) 用 CMCT 作為探針直接檢測靶 RNA 的二級結構

體外轉錄的 RNA 的 CMCT 修飾：①反應液組成如表。



管 1 作為反轉錄對照，置于冰浴中；管 2 作為 CMCT 修飾對照；管3作為 CMCT 反應管。

②加入 RNA，管 1、2 在 75℃  放置 2 min后，室溫放置 5 min。

③加入 MgCI₂，室溫放置 5 min，以使 RNA 二級結構形成，然后再冰浴 5 min。

④ 在管 3 中加入 CMCT 起始修飾，并冰浴 2 min。

⑤乙醇沉淀。加入 2 μl 5 moI/L NH₄Ac，1 μl 1 μg/μl tRNA，60 μl 無水乙醇，-70℃ 放置  10 min，然后以最大轉數離心 10 min，去上清，室溫放置以使乙醇揮發，置于冰浴中。

CMCT 修飾 RNA 的反轉錄。

① 在各管中加入含 10³~10⁵ cpm 的 ³²P 標記末端的反義寡聚核甘酸 (0.2 pmol) 的緩沖液 A，80°C 孵育 2 min，室溫放置 10 min。

② 加入 16.5 μl 緩沖液 B 和 0.5 μl (100 U) M-MLV 反轉錄酶（invitrogen)，50°C 孵育 20 min。

③乙醇沉淀。加入 5 μl 15 ml/L NH₄Ac，90 μl 無水乙醇，-70℃ 放置 10 min，以最大轉數離心 10 min，去上清，室溫放置以使乙醇揮發，用 10 μl 甲酰胺上樣緩沖液溶解，90℃ 放置 3 min 后置于冰浴中。

④ 取 4 μl 在10% PAGE-8 mol/L 尿素中電泳，并設立相同反義寡聚核酸的測序反應作為分子質量對照。放射自顯影后，根據測序反應的電泳圖譜來確定反轉錄得到的 cDNA 的大小從而確定 CMCT 修飾的位點。

3. 錘頭型核酶的體外切割

在檢測了選擇的靶位點序列的可接近性以后，必須首先確定所設計的核酶在體外對其靶位點的剪切效率，從而在體內應用前排除那些無效的核酶。

(1) 核酶 RNA (一般為 34 個堿基）和底物 RNA (一般為 13 個堿基）可以直接化學合成，也可以用體外轉錄的方法獲得。

(2) 底物 RNA 的末端標記（以 TaKaRa 的 T4 多聚核苷酸激酶為例）。

① 10 μl 反應體系包括 10 pmol 脫保護的含成 RNA 或轉錄產物，2 μl 5X Exchange Buffer(公司試劑盒提供），1.5 μl [ y ³²P ] ATP( 約 15 μGi )，1 μl T4 激酶。

② 37℃ 反應 30 min。

③ 70℃ 加熱 10 min，以使 T4 激酶失活。

④ 乙醇沉淀，加入 2.5 μl 10 mol/L NH₄Ac，25 μl 無水乙醇， -20℃ 過夜，14000 r/min，4℃ 離心 30 min，并用 70% 乙醇洗一次，室溫放置以使乙醇揮發，最后用 DEPC 水溶解。

(3) 剪切反應的時間進程。分析每個核酶的剪切時間進程，以便確定底物被核酶剪切 15% 時的時間點。該時間點常用來進行進一步多輪剪切反成動力學的分析，當 15% 的底物被剪切時，該反應仍屬于線性范圍，且仍滿足用 Michaelis-Memen 方程式所確定的核酶催化性質。若用核酶作為基因治療的手段時，除了需要檢測該核酶對突變位點的剪切能力以外，還必須檢測對野生型位點的剪切效率。

① 時間進程反應。總體系是 130 μl。

② 在 1.5 ml 離心管中混合 400 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，1 μl 核酶 (2 pmol，終濃度 15 nmol/L)，88 μl 水，65℃ 孵育 2 min 使 RNA 變性，室溫 10 min。

③ 加入 13 μl RNasin：0.1 mol/L DTT (1 : 10) 混合物， 13 μl 200 mmol/L MgCl₂ ( 終濃度 20 mmol/L)，37℃ 孵育 10 min。

④ 加入 2 μl 底物 RNA 啟動剪切反應， [ 1 μl ³²P 標記的底物和未標記的底物（20 pmol ) ] ( 終濃度為 150 nmol/L)。

⑤ 在 37℃ 孵育，取時間點為 0 min，2 min，5 min，10 min，15 min，30 min，60 min，120 min，180 min，在每個時間點取出 10 μl 反應液用 10 μl 終止緩沖液終止反應，并置于冰浴中。

⑥ 90℃ 3 min 使樣品變性，置于冰浴中，取其中 6 μl 在 10% PAGE-8 mol/L 尿素系統中進行變性膠電泳。

⑦ 放射自顯影。

(4) 物種特異性的檢測。核酶用于基因治療時必須要確定核酶的物種特異性，即它僅特異地識別突變的 mRNA 的特性，這種特性使異常的基因表達得到抑制。用 APQ ( allelic preference quotient ) ( 等于突變靶位點剪切率的測定值與野生型靶位點剪切率的測定值之比）來衡量特異性，剪切率從時間進程反應曲線中的線性區段中確定。當 APQ 小于 1 時表明野生型靶位點更容易被剪切，而APQ 大于 1 時則表明突變的靶位點更容易被切割。

(5) 競爭剪切時間進程分析。為了進一步分析核酶是否能區分出突變型靶位點和野生型靶位點，可以進行競爭分析，試驗方法同上，僅兩種底物的比例為 1：1。

(6) 多輪剪切反應動力學分析。為了獲得核酶催化反應的動力學參數（k_cat，K_m，V_max）需要進行多輪剪切反應動力學分析，體內核酶可被檢測出的最小 k_cat 值是 0.1 min^-1 (37℃，20 mmol/L MgCl₂ )。每個多輪剪切反應最少要進行三次，核酶濃度為 15 nmol/L， 底物濃度為 150~1500 nmol/L。為使核酶飽和，可能需要較高的底物濃度，但對大多數核酶來說，較低的底物起始濃度即已足夠。至少需要三個濃度的底物來分析多輪剪切反應， 以獲得準標曲線。



① 不同濃度的底物組成。30 nmol/μl 的底物：120 μl 無 RNase 的水，15 μl 300 nmol/μl 未標記底物，15 μl 標記的底物；3 nmol/μl 的底物：135 μl 無 RNase 的水，15 μl 30 nmol/μl 的底物；0.3 nmol/μl 的底物：99 μl 無 RNase 的水，1 μl 30 nmol/μl 的底物。各濃度的底物在加入反應體系中之前需在 37℃ 預熱至少 5 min。

② 核酶加入以后，在 65℃ 放置 2 min，之后在 25℃ 放置 10 min。

③ 加入 MgCl₂ 以后，37°C 孵育 10 min。

④ 加入預熱的底物以后， 剪切反應開始，剪切時間通過上述的時間進程分析來確定。

⑤ 加入 20 μl 終止緩沖液，終止反應。

⑥ 90℃ 3 min，使樣品變性，置于冰浴中，取其中 6 μl，進行 10% PAGE-8 mol/L 尿素膠電泳。

⑦放射自顯影。

⑧以產物生成速率的倒數為縱坐標，底物濃度的倒數為橫坐標，作出標準曲線，計算各動力學參數。

(7) 體外轉錄 RNA 的剪切時間進程分析。為了更真實地反映體內核酶的作用，首先通過體外轉求出含有靶序列的較長的具有更復雜結構的 RNA，從而分析該核酶識別和剪切全長 mRNA 的能力。

一般來說，可以構建靶 RNA 的全長 cDNA，或者以剪切位點為中心的至少 200 bp 的 cDNA，并以其為模板體外轉錄出 RNA。所選擇的 RNA 的剪切產物應易于與原底物在 PAGE 膠上分開。

將這種 RNA 的剪切時間進程分析力案與第 (5) 步競爭剪切時間進程分析比較。僅有兩點不同：首先，核酶與靶 RNA 的比例應該提高到 1：1~10：1；其次，由于這種長轉錄物與核酶的結合與解離的速度更慢，故選擇的時間點應為 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、24 h。

(8) 利用細胞提取物，直接分析核酶對天然 RNA 的剪切效率。

4. 核酶在細胞內的應用

將獲得的剪切效率最高的核酶基因序列構建入載體，導入細胞，分析目的基因的表達。

(1) 表達載體的構建策略。核酶的表達可以利用 Pol Ⅱ 和 Pol Ⅲ 啟動子。

Pol Ⅱ 啟動子的優勢在于，由它起始轉錄的 RNA 具有 5' 帽和 3'-poly (A) 尾，因而穩定且定位在細胞質中，還具有組織特異性；而 Pol Ⅱ 潛在的不利之處是原初轉錄物需要加工后才能保證轉運出核。可取代的方案是利用 U1 RNA啟動子，將核酶基因序列插入 U1 RNA 的編碼序列中或取代 U1 RNA 位于啟動子和轉錄終止信號之間的部分，這個方案的最大優點是產生的轉錄產物可與特異的 U1 蛋白結合而大大增加其穩定性。

Pol Ⅲ 啟動子一般啟動短的有高度結構的RNA，例如 tRNA，U6 snRNA，腺病毒 VA1 RNA，7SL RNA，Y RNA，5S rRMA，轉錄一般在 4~6 個連續的 U 處終止。核酶研究中已經利用的有腺病毒 VA1 RNA、tKNA、U6 snRNA 啟動子構建的表達載體。

(2) 核酶與靶 RNA 的共定位。細胞內核酶效率的決定性因素是核酶與靶 RNA 的共定位。因為特異的靶 RNA 可以定位在細胞中的不同部位（例如細胞核，核仁，細胞質）， 所以應該保證核酶能夠在靶 RNA 定位的相同的細胞內區域高表達。

(3) 核酶的導入，內源基因方式。可以用病毒載體或非病毒載體，例如可以利用重組腺相關病毒 ( rAAV ) 載體。

外源基因方式。化學合成或生物方法產生的 RNA 直接用于體內。化學合成的 RNA 還可以經過修飾以增加核酶的體內穩定性。化學合成的核酶 RNA 可以直接加在細胞培養基中或用陽離子脂質體轉入細胞。該策略的不利之處是為維持靶 mRNA 的低水平，需要不斷投入大量的核酶。

(4) 檢測體內核酶的生物學活性。可以利用引物延伸、Northern 雜交、RNase 保護試驗和 RT-PCR 等方法檢測體內靶 mRNA 的表達水平；也可以用特異的方法檢測靶 mRNA 編碼的蛋白質表達水平。