核酸凝膠電泳4

5、室溫下聚合至少30min，若聚合完全，梳齒下可見二條折光線，小心拔出梳子，用水沖洗樣品孔。
6、在電泳槽中加入1×TBE緩沖液，使緩沖液覆蓋樣品孔，并用緩沖液稍淋洗樣品孔。
7、加上1/6體積6×上樣緩沖液與DNA樣品及DNA分子量標準液中混合，用微量進樣器吸取，小心快速地加入加樣孔中（一般加樣量3~5μl）。
8、接上電極，以5V/cm（1~8V/cm）的電壓進行電泳。
9、參照染料遷移至所需位置時，切斷電源，取出凝膠床，小心撬去上面的玻璃板，檢查凝膠是否完好地附在下面的玻璃板上，按下列方法之一進行染色或顯影，檢測DNA的位置：
①溴化乙錠染色法：聚丙烯酰胺凝膠能抑制EB的熒光量，故用該法時，DNA量須大于10ng，將凝膠和玻璃板一起放入含0.5μl EB的1×TBE緩沖液中，30~45min后取出，水洗，紫外燈下觀察并照相。

②銀鹽染色法：靈敏度很高，適用于聚丙烯酰胺凝膠中DNA和RNA的染色。凝膠先在50%甲醇、10%乙酸中浸泡30min；50%甲醇、7%乙酸中30min；10%戊二醛中固定30min；用水洗去多余的固定劑，然后用0.1%硝酸銀浸泡30min，在100ml 3%碳酸鈉（含50μl甲醛）中顯影，直到獲得滿意效果。加5ml 2.3mol/L檸檬酸，攪動10min，即可中止反應，用ddH2O洗滌30min后浸在0.03%碳酸鈉溶液中泡10min，置封閉口袋中保存。
【注意事項】
1、凝膠以1×TBE緩沖液并以低電壓1~8V/cm電泳，同時凝膠應盡可能薄，以防電泳時產熱過大，引起DNA變形，導致出現“微笑”DNA區帶。
2、Acr是強烈的神經毒素，可經皮膚吸收并具有累積性，操作時必須戴手套和口罩。
3、核酸的PAGE通常采用連續系統，沒有濃縮階段，因此核酸樣品體積不能太大。
方案二 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
【原　理】
變性聚丙烯酰胺凝膠，用于分離和純化單鏈DNA（RNA）片段，這類聚丙烯酰胺凝膠是在核苷酸堿基配對抑制劑（尿素或甲酰胺）存在的情況下聚合而成的，DNA的遷移率和堿基的組成及序列無關，故可用于分離同位素標記的探針、分析SI核酸酶的產物和DNA測序等。變性PAG常用于：①測定雙鏈DNA的長度；②回收寡核苷酸。此方法迅速、簡單、分辨率高，雖然產量較低（<50%所加樣品），但也足以滿足大部分工作的需要。
【試劑及配制】
1、5×TBE（見方案一）
2、42%丙烯酰胺
丙烯酰胺 40g
甲叉雙丙烯酰胺 2g
加雙蒸去離子水至100ml。
3、TEMED
4、尿素
5、10%過硫酸銨（AP）
6、2×甲酰胺上樣緩沖液
5×TBE 0.2ml
去離子甲酰胺 0.9ml
10%溴酚藍 50μl
7、0.3mol/L乙酸鈉（pH7.5）
8、TE緩沖液（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl、1mmol/L EDTA）
【操作步驟】
1、制備PAG-尿素凝膠，按寡核苷酸長度選擇適當濃度的凝膠（12%、15%、19%的尿素丙烯酰胺濃度分別對應被分離合適的寡核苷酸長度40~100、25~40、<25nt）。按下列混合：25.2g尿素（終濃度7mol/L），12ml 5×TBE，42%丙烯酰胺（所需量），加水至60ml，加10% AP 200μl和TEMED 30μl，混合并倒膠（避免氣泡產生），在室溫下聚合30min以上。
2、取出梳子，安裝電泳裝置，在電泳槽中加入1×TBE。1500V電壓預電泳15~30min。
3、用等體積的2×甲酰胺上樣緩沖液稀釋樣品（上樣前可在90℃加熱3min以除去二級結構的干擾），產生清晰的帶需要10μg寡核苷酸。
4、用TBE沖洗上樣孔數次洗凈尿素，上樣。
5、1500V電壓進行電泳，當溴酚藍遷移至凝膠底部時，停止電泳。
6、卸下玻璃板，水平放置，撬起上面的玻璃板，用保鮮膜蓋住凝膠，翻轉玻璃板，取出底面的板，同樣用保鮮紙蓋住。
7、在短波長紫外燈下觀察，用干凈刀片切下所需的DNA條帶，將凝膠條放到小離心管中。
8、每2cm的凝膠小條加0.5ml 0.3mol/L乙酸鈉，室溫下在搖床中洗脫過夜。
9、將溶液轉移到另一干凈管中，避免吸取凝膠碎片。用酚、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，干燥樣品后再重懸于ddH2O或TE中。
【注意事項】
1、預電泳是為了使AP遷移出樣品孔，并將凝膠加溫至最適于DNA電泳的溫度。
2、第7~9步為了回收DNA的方法。