核酸抽提經驗及原理

1、核酸抽提原理 
簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離的過程。 經典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞(如 EDTA)、維持核酸結構的穩定 (如 NaCl)等。去污劑則是通過使蛋白質變性，破壞膜結構及解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質變性劑 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。 zui常用的純化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介質純化。*種方法是利用 PC對裂解體系進行反復抽提以去除蛋白質，實現核酸與蛋白質的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質及鹽的特點，實現核酸與蛋白質及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質是*種純化方法的一個變體，省略了 PC操作的麻煩。當然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質 – 如多糖、多酚等 -的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現的。
2、了解你的實驗樣品 
如果你研究某個實驗樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質含量。如果你對樣品的特點一無所知，當樣品稍微有一點復雜時，抽提核酸的實驗就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。 絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得zui好的結果。對一些雜質含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組 DNA 是碰到雜質殘留過大的問題，可以試一下 -20C保存一天后再抽提的對策，可能會有意想不到的效果。樣品如果因為某些原因必須先行保存，也要先簡化一下樣品：血液zui好只保存有核細胞；將樣品分割后保存，避免反復凍融。如果實驗室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個不錯的選擇。
3、裂解方法的評價 
含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質變小，故而對蛋白質的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組 DNA是很容易"纏"住大分子的東西的，蛋白質被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA"纏"住，有利于蛋白質在純化操作中的去除，使zui終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質"纏"在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優勢，則純化時以 DNA的形式被保留下來，導致蛋白質的殘留；如果蛋白質的特性占優勢，則純化時以蛋白質的形式被去除，導致 DNA 的損失。有些樣品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質)，原因在于這些樣品中的蛋白質，是非常難以去除的。該方法是獲得zui大得率和zui高純度的基礎。 不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細胞基因組 DNA抽提方面有優勢，尤其是當得率和純度要求不是zui高，而經濟性及操作簡單很重要時。控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關鍵。該方法結合高鹽沉淀，可以實現zui簡單的操作，但純度及得率的穩定性可能會比用 PC 抽提的差一些。 高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首選。總 RNA 的抽提，zui重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質的裂解以及基因組與蛋白質"纏"住的問題，因為都不會對以后的純化產生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內的 RNA酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質變性劑為基礎的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非常快速簡單，但純度不是很高。 含 CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個因素有關：一是 CTAB的質量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產的純度一樣的CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時， CTAB的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關鍵。裂解時的溫度，多使用65C；但如果發現降解嚴重或者得率太低，可以試一下 37C – 45C 這個相對低溫的區域。 SDS堿裂解法是質粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA污染的特點。控制好裂解液/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關鍵。蛋白質的沉淀效率在 4C 會更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C靜置一段時間以及采用 4C 離心去蛋白質，都可以提高質量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結合 PC 純化，可以獲得純度很高的質粒。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在zui后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml)來實現。總的感覺是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質粒(50 kb 以上)，該方法可能會有問題。 PCR模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非常快速。也正因為不純化，所以，假陰性 (即沒有擴增出來的陽性)比例也比較高。該方法zui簡單的裂解液就是水，復雜一點的就會含有一些不會抑制后續的 PCR 反應，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內抑制PCR 反應雜質的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復雜一點的就會含有諸如 Chelex 100之類的能吸附部分雜質的介質。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環等。該方法zui適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因為樣品量的降低，同時意味著 PCR 的抑制物量的降低。 選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴肅的參考資料，都應該會提供一個簡單的比例，如1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C個細胞；我的建議是，你的樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數次成功實驗所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎，會比較合理的。不要因為 1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結果 (純度及得率)沒有關系，然而，在實際操作中，對結果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質的過程復雜且不徹底，導致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準，這一點務必牢記。 
4、純化方法 
評價 PC 抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩定、可靠、經濟、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質為蛋白質)，該方法完全可以獲得高質量的核酸。雖然每次 PC抽提都會損失一部分核酸(因為不可能將水相全部移取)，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調整而得以解決或者減少影響。該方法的zui大的問題是不適合大規模抽提。 PC抽提是去除蛋白質的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質變性，變性后的蛋白質從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC抽提的關鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質的充分接觸，使蛋白質完全變性。許多人總是擔心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強烈到 DNA變成 10kb 以內的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 –此時的關鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質難以徹底去除，以及基因組 DNA會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA的特點，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質之前，是不能使用 PC抽提的，否則核酸必定降解。 高鹽沉淀蛋白質/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC抽提方法相比，除了純度的穩定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質所伴隨的好處是，可以用于大規模抽提，不足是純度 (蛋白質殘留) 不夠穩定。蛋白質的沉淀效率在 4C會更好一些。 介質純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其zui大特點是非常適合大規模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩定性很高 (雖然純度不一定比PC純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質被預先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀(如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質的純化操作與經典的醇沉淀差別不大，都是通過數次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質純化方法的成本是zui高的。
  5、醇的沉淀 
醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現核酸與其它雜質 – 主要是鹽 –的分離。實際操作中，許多雜質也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當其它雜質的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。 就核酸而言，標準的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發現，當裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(當然，得率可能會降低)。知道這一點的意義在于：不要迷信標準方法的*性；相反，當使用標準方法碰到問題 – 主要是純度問題 –時，完全可以通過調整沉淀條件來改善。zui有參考價值的是 TRIzol提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質的沉淀過程；調整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因為可以大大提高純度。 如果核酸抽提的起始樣品是比較"臟"的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當核酸濃度很低時，效果明顯；當核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導致雜質的大大增加。 醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發現這二者對質量有大的影響，雖然許多人"發現"乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現象，提示結論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀 (量少，洗滌不是問題，不丟失為先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丟失不是問題，洗滌方便為先)。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過(我幾乎不使用低溫沉淀，難道低溫沉淀比較容易出現鹽沉淀？)；我更覺得出現該現象的原因就在洗滌的不徹底。 當然，也不要忘記異丙醇沉淀的zui大優點是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml離心管內完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀zui終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質量決不會有問題的。 PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。
6、洗滌 
洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當核酸沉淀比較大時(使核酸沉淀zui終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是"倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻"，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因為他來自國外，自然就有了"水土不服"的問題。如果離心管是經過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非常可觀，其殘留量多到會影響后續的實驗。*不受管子質量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關。揮發時去掉的是乙醇，雜質是不會被揮發去除的。 另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數也要考慮增加。zui關鍵的，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。
7、核酸的溶解和保存 
純化后的核酸，zui后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險；如果操作過程控制得當，DNase的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。 基本上，核酸在保存中的穩定性，與溫度成反比，與濃度成正比。雖然也有部分實驗人員發現，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的穩定，我卻寧可認為這是個例。 如果溫度合適，保存中核酸發生降解或者消失，首要原因是酶殘留導致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適
導致的水解 (RNA在弱酸性更穩定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的，就是 EP管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發生反應，達到某種均衡。EP管的材質，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導核酸的結構發生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現象可能觀察不到；當核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩定核酸，雖然已經為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當回事。 現在制造 EP 管的材料遠多于過去。這些新出現的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP材質要好許多，但其化學特征，尤其是對核酸穩定性的可能影響，遠沒有研究透徹。正如現在的質粒可以改造得越來越適用某些要求一樣，其負面產物可能是，抽提的質粒電泳的構型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。 
8、核酸質量的檢測問題 
將抽提好的核酸直接用于后續的實驗，是*可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍)，該方法還是非常可信的；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準確度與經驗有關；另外，電泳也可能提供某些雜質污染的信息，但是同樣與經驗有關。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結果并不十分可信。一般講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合二者的結果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現壞的結果能用于后續實驗而好的結果卻不能用于后續實驗，也不用大驚小怪。 關于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始。(沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當真。)其次，一定要經常調較儀器；調較可以使用非常純的自備核酸，也可以使用苯酚 (后者是我目前每次都使用的方法，非常簡單；具體道理可以見我以前的帖。)zui后，要記住讀數 A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 為 1.8) : 1為理論上的數據，實際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了。有兩個值得商榷的觀點：如果 A260/A230 > 2就是純的，如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多，一定是有雜質殘留的(具體是什么雜質我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測定，A260/A280 > 2.3 決不提示核酸降解，原因是：那些能導致A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小，常規的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280實際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280則正好是半山坡。根據曲線在底和頂的斜率zui小，在半山坡的斜率zui大的特點，不難得出如下結論：A230 和 A260的讀數受儀器準確性的影響比較小，而 A280 受儀器準確性的影響比較大。 建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考 (降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。 
9、問題解答 
A 抽提過程中的現象及可能的原因 I：核酸不溶解或者難溶解 – 蛋白質殘留 (雖然目前更多的資料強調的是過分干燥所致。)。75%乙醇洗滌后，如果是空氣干燥，幾乎不可能過分干燥的，尤其是在南方潮濕的地方。佐證實驗：撕取少量 Merck 的絲狀CT DNA到一個離心管中，加入無水乙醇；10 分鐘后徹底去除乙醇；待乙醇完全揮發后，加入 TE，10 分鐘后溶液就非常均勻而粘稠了。 II：使用異丙醇沉淀核酸，沉淀為白色 – 多糖殘留。 III：核酸溶解后為乳白色 – 多糖殘留。 IV：75% 乙醇洗滌異丙醇沉淀的核酸時，沉淀變大了 – 見 10-III。
B 紫外檢測 I：A260/A280 比值低 – 蛋白質殘留。但如果操作過程中使用了苯酚，則更可能是苯酚殘留。 II：A260 值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差 – 苯酚殘留。
C 電泳中的現象及可能的原因 I：加樣孔有熒光 – 首先一定有 DNA 的滯留；其次多含蛋白質殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質也可能導致熒光。蛋白質幾乎不會被 EB染色，能出現熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組DNA (>50kb)，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，單獨就可能滯留在加樣孔中產生熒光。更多的時候，是比較大的 DNA與殘留的蛋白質結合后，電泳不能出孔而在孔中產生熒光。酶反應產物，如果沒有經過純化去除酶，也非常容易在孔中出現熒光，其原因是酶與核酸幾乎都有比較強的結合能力 (基因組 DNA 的PCR產物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強度與體系的特異性成反比。)。如果是植物樣品，還可能由其它雜質殘留引起。我的經驗是：蛋白殘留的熒光有點發悶，其它雜質殘留亮得很刺眼，且薄得銳利。 II：總 RNA 非變性電泳顯示過多的條帶 – 根本就不是問題。 III：總 RNA 非變性電泳顯示 28S 不如 18S 亮，但條帶清晰無彌散 – 多提示 28S 沒有被 EB 飽和。RNA 殘留多時，基因組 DNA 的電泳也會有相似現象。簡單的補染可以解決此問題。再次電泳時，或者降低上樣量，或者增加膠中 EB 的量。
D 降解的現象、原因及對策 降解的現象，如果拋開問題電泳所致，可以簡單總結如下：主帶不再突出，向小片段方向發生彌散，亮度比較均衡地衰減。如果同時還伴隨下列的一個或者多個現象，則需要更進一步的檢測：加樣孔非常的亮、彌散發生在主條帶位置的上下兩個方向、從加樣孔即開始發生彌散。 以現在的裂解液的裂解能力而言，降解的發生主要是在徹底勻漿之前，只有極少量由不干凈的溶解液導致。以總 RNA 抽提為例，本站就有帖總結為：總RNA 的質量由高到低依次為懸浮細胞、貼壁細胞、組織(此處的質量不僅指純度，也指完整性才對)。徹底裂解懸浮細胞的時間zui短，徹底裂解組織的時間zui長，這就是降解多發生在徹底勻漿之前的一個佐證。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品，非常嚴格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質量；但是，有許多實驗室并不具備嚴格的保存手段，實驗人員的操作也并非完美，其結果就是核酸的降解。RNA 抽提受的影響因素太多，就以基因組 DNA 的抽提為例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K的溶液，無論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品，如果混勻徹底，可以預期的降解為：細胞 – 不應該降解，碾碎的組織 – 不應該降解，大塊組織(包括鼠尾) –部分降解。如果電泳發現新鮮的細胞和碾碎的新鮮組織發生了降解現象，該現象是假象；如果電泳發現冷凍的細胞和碾碎的冷凍組織發生了降解現象，該現象不是假象，就是樣品在保存中已經降解了。說得更極端一點，即使蛋白酶 K 失活了，消化試劑的裂解能力也足以保證細胞的基因組 DNA在抽提過程中間不被降解。 減少或者杜絕核酸降解，一定要將重點放在樣品被徹底勻漿之前。樣品的保存在前面已經說過了，不重復。其次就是要縮短樣品從脫離原來的生存環境或者低溫到被徹底勻漿之間的時間。
E 后續酶反應失敗 資料書中連篇累牘的原因我就不說了，因為都對。我相信因為大家首先相信的就是它們，所以碰到問題首先一定會從那些方面著手。如果三次實驗后，問題還沒有解決，那么 90%的可能在于洗滌方式的不嚴格導致的小分子物的殘留。小分子物像刀，可以陸續"殺"死很多酶；大分子物如蛋白質，像繩子，只能"捆住"一個目的核酸或者酶。更嚴格的洗滌可以解決該問題。
F 蛋白質是如何殘留的 PC 純化：a-取上清時取到中間層及下層；b- PC 用量不足；c-混勻不徹底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白質。 高鹽沉淀：a-取上清時取到了蛋白沉淀；b-裂解不徹底；c-裂解液用量不足，使裂解體系太粘稠；d-溶解度問題 (可以使用低溫沉淀加以改善)。 介質：a-裂解不徹底；b-裂解體系太粘稠。
G 小分子物質 (苯酚、鹽) 是如何殘留的 醇沉淀：洗滌不徹底。其原因與管子、操作手法等有關。 介質：顆粒狀介質的原因與醇沉淀相同。柱式的幾乎都是柱子設計上的缺陷所致，極少數由操作者未嚴格按要求操作所致。
10、某些我使用的操作手法 
實驗做多了，的確希望能偷點懶；偷懶也有講究，否則就是偷雞不成失把米。下面就是一些在確保抽提成功前提下的通用操作方法；有些看起來很麻煩，但請想一想抽提失敗后的再次抽提，應該是可以算偷懶的方法了： I：混勻操作 (1.5ml 離心管內) – 如果液體體積在 100ul 以內，用指頭彈擊尖底混勻；在100-400ul 之間，用振蕩器混勻；大于400ul，用手晃動混勻：晃動時使離心管底永遠處于斜上位置，頻率要快。 II：PC 抽提時上清的移取 – 離心管傾斜，根據上清的量選擇不超過 200ul 的移液器，在外面先壓下移液器，再將 tip 移入上清。Tip 要盡可能靠近液面，tip 的尖嘴接觸內壁，緩緩松手吸取上清。可多次移取，但決不要使用 1ml 移液器。 III：核酸的洗滌 – 核酸沉淀后離心，將上清倒掉。如果核酸是來源于雜質比較多的樣品 (如植物、動物肝臟、細菌等)，則在加入 75%乙醇之前，再將離心管短暫離心后，用移液器將殘留液體徹底吸出，否則，75% 的乙醇非常容易將殘留液體中的多糖等雜質給沉淀下來。移取 75%乙醇使用一次性的塑料吸管，加入后將核酸徹底懸浮起來，置于室溫一段時間 (時間長短取決于沉淀大小)，期間多混勻幾次。如果去除 75%乙醇的操作是"離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體"，則洗滌 2 次；如果去除 75% 乙醇的操作是"離心后倒掉"，則洗滌 3次，但zui后一次仍然采用"離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體"。這樣洗滌的目的，是確保小分子物的殘留低于 10 萬分之一 (zui大殘留不高于10uM 級)。 
11、一些特別的問題 
a：EP 管的問題 幾乎沒有人會認為 EP 管的質量會與核酸抽提的操作有關，與某些現象 (如核酸在 -20C 保存一天后發生了降解) 有關系，但事實是，EP 管的質量的確與核酸抽提的質量以及核酸保存時的穩定性有關。 硅化可以提供zui高質量的 EP 管，使某些奇怪的現象消失或者大大減輕。zui糟糕的 EP 管對液體有較強的吸附力，在傾倒液體時殘留多，核酸在管中保存的過程中會發生變性。這樣的管子是很有市場的，因為便宜；而正因為便宜，其材料總是不令人放心的。 我個人認為，只有硅化過的 EP 管，才可能按照標準操作獲得滿意的結果。否則，某些操作步驟必須調整，才可以獲得穩定的質量。
b：核酸抽提中的溫度問題 核酸抽提中的溫度問題，也是一個值得關注的問題。首先要明確的一點是，任何一個溫度條件，對某些方面有利，同時也一定會有不利的一面。如沉淀，低溫操作會提高得率，但也會增加雜質的殘留。任何一步操作該用什么溫度為好，應該是利弊權衡的結果。基本上，除了一些特殊的步驟，如消化等外，用室溫是zui好的選擇。那些認為"低溫操作可以防止或者減少降解"之類的理由，并沒有多少可操作性的。低溫的確可以減低酶的活性，但低溫同時也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度，