梳理保存微生物組樣品同時不改變其多樣性的方法

　　在過去十年左右，研究人員已花費幾十億美元對棲息于不同地點（如人體、土壤和海洋）中的微生物進行分門別類。對這些不同的微生物組，我們所知的大多數信息都是通過日益復雜的下一代測序技術獲得的。比如，科學家們通常對編碼16S rRNA---細菌核糖體小亞基中的一種組分---的基因進行高通量測序來測量樣品中的微生物多樣性。當研究人員想要對樣品內所有有機體中的所有基因都進行測序時，那么鳥槍法宏基因組（shotgun metagenomics）是一種用于微生物組研究的配套技術。這些DNA測序技術非常靈敏，能夠區分污染或者危害的樣品處理導致的細微變化。

　　因為樣品處理和儲存上存在的差異能夠影響一項研究的結果，所以維持現場收集到的樣品的完整性是微生物組研究所面臨的一項重大挑戰。位于美國明尼蘇達州羅切斯特市的梅約診斷博士后研究員、微生物學生態學家Vanessa Hale說，金標準方法就是立即抽取新鮮樣品中DNA或RNA。當立即處理不可行時，最好的方法就是將樣品儲存在?80 °C下。糞便樣品中的微生物組成在室溫放置一到兩天后就開始發生變化（參照文獻1和2）；其他的樣品，如土壤，也具有類似的溫度敏感性。然而，獲取一種超低溫冷藏箱（ultra-low-temperature freezer）并不總是可能的。比如，研究對象可能需要在家收集糞便樣品，或者研究人員可能在偏遠地點收集土壤樣品。在一些情形下，在對DNA和RNA進行提取和分析之前，必須將樣品儲存和保藏數天或數周。

　　美國芝加哥大學微生物生態學家Jack Gilbert說，“微生物組是如此多樣性和復雜。你做的任何一種特定事情都將改變[它的]一部分。”隨著技術允許對微生物環境進行更加深入的研究，即便微生物群體的存在或相對豐度發生最為微小的變化，也能夠顯著干擾群體比較。一種儲存方法所導致的變化越少，結果就越好。

　　《科學家》雜志與微生物組專家進行溝通，讓讀者了解如何儲存樣品同時保存它們的微生物多樣性。

　　1.確保樣品均質化

　　維持原始樣品的保真度開始于收集的那一刻。第一步就是確保擁有均質性的樣品。比利時根特大學微生物學家Kim Heylen說，“如果樣品沒有均質化，那就讓它均質化。如果想要擁有可以復制的二次抽樣樣品（subsample），[這樣做]是至關重要的。”

　　美國加州大學戴維斯分校微生物學家、博士后研究員Holly Ganz在一家非盈利機構KittyBiome開始職業生涯，其中該非盈利機構研究野貓和家貓的微生物組，研究對象通常為它們的糞便樣品。Ganz說，“糞便并不是均質性的。它存在一個問題：以糞便中哪一部分為樣品將影響研究結果。” Ganz首先移除糞便的外層，這是因為外層可能含有環境污染物，接著將糞便剩余部分放入塑料袋中以便一起磨碎和混合。接下來，她將樣品沿著薄板鋪展開來，并且從中二次抽樣樣品。她說，“讓糞便均質化是非常困難的，因此我只是增加我獲取二次抽樣樣品的次數。”

　　在最近對人腸道微生物組的研究中，研究人員利用研缽及研杵搗碎加有液氮的糞便樣品，然后將形成的粉末分配成較少的樣品，轉移到試管中，然后在?80 °C下凍存。相比于來自未均質化的新鮮樣品的二次抽樣樣品，利用這種方法制備的樣品在微生物組成上表現出減少的變化（參照文獻3）。

　　土壤具有更加復雜的基質。Gilbert建議將土壤樣品放入攪拌機中盡可能地攪碎顆粒物。他說，“完全均質化是不可能的。”

　　研究人員也建議在初次收集樣品后，進行多次重復地等分，這是因為多次凍融循環破壞核酸質量。比如，科學家們使用無菌的一次性活檢鉗（biopsy punch）從一個更大的原始樣品中收集幾乎相同大小的凍存糞便顆粒。然后，直接將這些顆粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。這種方法僅僅通過對原始的樣品進行等分，為科學家們節省整整一次凍融循環。

　　2.應當使用一種低溫保存劑？如果應當，那么使用哪種？

　　低溫保存劑（cryopreservant）---在給定樣品中讓核酸保持穩定的緩沖液---提供低技術的冷藏液。低溫凍存讓細胞免受凍結溫度下的冰塊形成和溫度波動導致的機械損傷。

　　使用哪種低溫保存劑主要依賴于計劃如何使用樣品。如果想要培養細菌或者需要讓它們活著，那么可能使用甘油，它阻止冰晶在低至?20 °C～?80 °C的溫度下形成。位于美國馬薩諸塞州梅德福市的非盈利性糞便庫OpenBiome收集來自健康人的糞便樣品來治療感染上艱難梭菌（Clostridium difficile）的病人。OpenBiome質量經理Daniel Blackler說，鑒于糞便移植治療的成功依賴于擁有活的細菌，因此將糞便樣品與含有12.5%甘油的鹽溶液混合，然后在?20 °C下可儲存長達6個月，在?80 °C下可儲存長達2年。

　　如果研究人員只是計劃研究核酸組成，那么他們有更多選擇。對這種類型的研究而言，在儲存之前，將樣品加入到一種裂解液中。盡管很少有研究比較了不同低溫保存劑在維持原始樣品多樣性上的影響，但是已有證據提示著低溫保存劑能夠在不同程度上影響不同微生物物種的存在（參照文獻4）。Hale建議道，“關鍵在于針對自己的研究，選擇一種可行的和合適的方法，同時也意識到它的潛在差錯。”

　　總體而言，研究人員發現加入一種低溫保存劑有益于人類樣品。Ganz注意到，在比較儲存的樣品和新鮮樣品的微生物組成之前，一種快速地評價低溫保存取得成功的方法是看一下DNA產量。她說，“如果不能獲得足夠的DNA，那么就不能足夠好地代表[樣品中的]微生物組。”

　　2.1 二甲基亞砜+海藻糖+胰酪大豆胨液體培養基

　　Heylen使用二甲基亞砜（DMSO）溶液、海藻糖和胰酪大豆胨液體培養基（Tryptic Soy Broth， TSB），從而有助維持三種微生物組系統中冷凍樣品的保真度（參照文獻5）。Heylen說，“海藻糖阻止細胞干燥，而TSB也是一種低溫保存劑。”她建議先將這種溶液放置在大約4 °C下，然后將它加入到即將放入一種超低溫度冷藏箱內的樣品中。“如果沒有?80 °C冷藏箱的話，那么也能夠使用家用冷藏箱。但是肯定要盡可能快地凍存樣品，而且在沒有一種低溫保存劑的存在下不要凍存。”

　　2.2 保存劑RNAlater

　　起初開發出來是作為一種RNA保存劑使用的，RNAlater是一種無毒的水溶液，由諸如Qiagen公司（50mL的78美元，250mL的324美元）和Thermo Fisher公司（100mL的125美元；500mL的386美元）之類的制造商銷售，也能夠被用來保存DNA。在與人類微生物組項目（Human Microbiome Project）合作時，哈佛大學陳曾熙公共衛生學院（Harvard T.H.Chan School of Public Health）計算生物學家Curtis Huttenhower和他的同事們發現在樣品收集后，如果沒有冷藏箱可供使用的話，那么加入這種保存劑也能夠起作用。

　　但是RNAlater也具有一些用戶報道的缺陷。盡管它沒有可燃性的事實使得這種保存劑成為一種用于樣品運輸的合適選擇，但是相比于新鮮提取的樣品，它顯著地降低擬桿菌門（Bacteroidetes）細菌和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）細菌群體。Ganz建議道，“RNAlater阻止樣品正常地形成顆粒沉淀，因此在移除RNAlater之后，不得不再次利用磷酸鹽緩沖液清洗這種沉淀。”

　　根據美國伍茲霍爾海洋研究所海洋生物化學家Mak Saito的說法，RNAlater的另一個潛在問題是它的高鹽含量，這對一些醫學實驗程序而言，進行樣品處理也令人頭疼。Saito利用這種溶液協助保存海洋微生物組中的蛋白組成（參照文獻6）。

　　2.3 乙醇

　　相對于RNAlater而言，乙醇是一種更加便宜的替代性選擇，而且已證實它在八周多的時間內穩定地保存糞便樣品中的微生物群落結構，即便是在室溫下，也是如此（參照文獻4）。然而，乙醇是可燃的，因此它不能用于樣品運輸之中。更重要的是，相對于新鮮收集并進行分析的樣品，利用乙醇進行的低溫保存導致藍藻細菌（Cyanobacteria）數量增加。Ganz說，“所有這些儲存方法都會帶來偏差，因此研究中總是使用同一種方法是較為重要的。” Ganz是在接受儲存蜘蛛猴糞便的同事們的建議之后，將她收集的貓糞便樣品保存在70%乙醇中。

　　2.4 不使用低溫保存劑

　　對一些類型的樣品而言，加入一種低溫保存劑會改變微生物組成太多而不值得。Gilbert說，土壤就是這種情形。他建議在?80 °C下凍存土壤樣品48小時。他說，“我們想要在收集這種樣品時就看看它的微生物群落組成和結構。”在土壤樣品非常潮濕的環境中，Gilbert推薦立即凍存它們，這是因為高水分含量能夠導致某些類型的細菌增殖。

　　對糞便樣品而言，有時低溫凍存也并不合適。Blackler說，比如，用于治療艱難梭菌感染的糞便樣品能夠在室溫下保存長達6個小時，同時不會導致治療質量發生顯著變化。

　　3.其他的溫度考慮因素

　　微生物組樣品對凍融循環非常敏感。Hale說，“解凍能夠導致微生物組樣品產生嚴重偏差。在每個凍融循環期間，DNA都會降解，而且當樣品解凍時，污染和微生物大量生長的情形也能夠發生，此外，揮發性化合物丟失并且不能回收用于潛在的代謝組學分析。”

　　如果只有?20 °C冷藏箱可供使用，那么這種冷藏箱最好只用于儲存微生物組樣品。Heylen說，“如果?20 °C冷藏箱持續打開，那么溫度能夠發生變化，這會使得儲存成功率顯著下降。”

　　在OpenBiome，研究人員在將樣品轉移到?80 °C下儲存更長時間之前，讓它們在?20 °C下持續凍存長達6個月。Blackler說，將樣品轉移到超低溫冷藏箱中應當不會對微生物產生負面影響。然而，“溫度突然上升應當盡可能地避免，因為這會影響微生物群落。”