檢測細胞增殖的種類以及方法步驟

目前主要有兩種用于檢測細胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂的細胞數來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數目來評價細胞的增殖能力。顯然，細胞活力檢測法并不能最終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。如細胞在某一培養條件下會自發啟動凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發生；這時若采用細胞活力檢測法，顯然可以區分兩種條件下的細胞數量，但我們并不能從藥物干擾組細胞數大于對照組的事實說明藥物可促進細胞增殖的結論。所以最直接的證據應該采用方法一。
用于檢測細胞增殖能力最經典的方法是用氚標記的胸腺嘧啶核苷處理細胞，再檢測DNA鏈中氚含量。若細胞具有增殖能力，DNA合成過程中將會采用氚標記的胸腺嘧啶核苷作為合成原料，因此檢測細胞DNA鏈內標記核苷酸的量可判斷細胞是否進行DNA的合成。
但更為常用的方法是BrdU檢測法。用BrdU預處理的細胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩定存在，并帶到子代細胞中。細胞經過固定和變性處理后，可用免疫學方法檢測DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗標記，最后用比色法或熒光的方法進行定量測定），從而判斷細胞的增殖能力。
Calbiochem/EMD公司提供一種BrdU檢測試劑盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、變性的步驟以單一試劑當中。比色檢測在一抗二抗標記后在450nm下讀數，所有操作在3小時內結束。而且該試劑盒的靈敏度與市場上其他同類產品相比是最強的。1000個細胞以上水平的檢測只需用BrdU預孵育2小時，100個細胞則采用過夜預孵育，即可檢測細胞的增殖能力。
BrdU法的一個缺點是需要固定和變性等破壞DNA的處理。有些情況下，研究者可能希望在測定細胞增殖能力的同時檢測細胞的總DNA含量，然而，在變性條件下，DNA的雙鏈結構將被破壞，DAPI和Hoechest 33342等核酸標記探針就不再能識別DNA，因而也無法估計DNA總量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU(5－乙炔－2'－脫氧尿嘧啶)檢測試劑盒可以解決這個問題。這種方法不需要變性步驟，因為熒光探針標記的疊氮化物小分子，而不是龐大的抗體分子，可以很輕易的識別并結合未變性DNA雙鏈中的EdU分子。
采用BrdU方法時，你必須非常小心的去對DNA進行變性，才能一方面使BrdU抗體進入細胞，另一方面又保留足夠的雙鏈DNA分子來進行細胞周期的分析。有了EdU后則不同，由于你不再需要變性，這一切都很簡單了；另外，常常用于DNA變性的HCl，可能破細胞內壞蛋白的抗原識別位點，因而限制了BrdU檢測法中同時檢測其他蛋白的應用，但這種情況在EdU法中不存在。

圖1：EdU及BrdU原理示意圖（摘至invitrogen說明書）
在一些情況下，細胞活力的檢測相當于細胞增殖能力的測定。用于細胞活力檢測的方法又很多，這些方法主要采用特殊的試劑來測定細胞的代謝活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑鹽。它們通過檢測細胞的氧化還原活性來檢測細胞增殖能力，所以這是一種間接的方法。
Calbiochem的快速細胞增殖試劑盒，或者，嚴格來說，叫細胞活力試劑盒，采用一種四唑鹽試劑WST-1來對細胞活力進行快速的檢測。線粒體剪切WST－1試劑，產生一種水溶性的formazan鹽，所以這是一種相對可靠的測定健康細胞活力的方法。一種類似的但更為靈敏的方法是Calbiochem公司的超敏細胞增殖試劑盒，采用calcein-AM（一種熒光探針）來標記細胞。這種增加的靈敏度來自于額外的檢測步驟，即采用PBS替代培養基或血清來減小背景。
Invitrogen公司還提供了一種采用熒光素酶檢測細胞內ATP水平的方法。健康細胞中熒光素激發出的光可以很容易讀出，并且具有非常小的背景。無熒光信號表明細胞線粒體不在產生ATP。因此，這些方法當然也可用于細胞毒性檢測實驗。
細胞增殖檢測方法：總論
一、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法
胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質。用同位素3H標記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DAN的代謝及細胞增殖情況。但是具有放射性。
二、MTT檢測法
MTT檢測法主要反映細胞的能量代謝，是檢測細胞增殖活力的一種簡便準確的方法，其原理是在活細胞生長和增殖過程中，線粒體內的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲（Formazan），生成的甲量的多少與細胞的數量和細胞的活力成正比
三、羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法
羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異性結合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團，使C E成為一種良好的細胞標記物。CFSE進入細胞后可以不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯到細胞蛋白質上。當細胞分裂時，CFsE標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。這樣，在一個增殖的細胞群中，各連續代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發光和熒光檢測通道可對其進行分析。
四、Brdu檢測法
Brdu中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活體注射或細胞培養加入，而后利用抗Brdu單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。