實驗概要
植物制片技術是植物顯微技術的一個重要組成部分,在有關植物形態建成、植物雜交育種、作物病蟲害防治、藥用植物的培育和鑒別以及林木材性鑒定等多方面的研究工作中,都需要應用顯微制片技術,本實驗介紹了植物制片基本方法。
主要試劑
1. FAA固定液(福爾馬林-冰醋酸-酒精),又稱萬能固定液或稱標準保全液。
適用范圍:一般根、莖、葉、花藥、子房的組織切片都可使用此固定液。
固定時間:一般需固定24小時,并可在此液中作較長期的保存,但溫度宜低(10℃左右)。
配法:
(1) 福爾馬林(38%甲醛) 5mL
(2) 冰醋酸 5mL
(3) 70%酒精, 90mL
注意:
(1) 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,以防止材料收縮。
(2) 制片時,材料不必洗滌,直接入70%酒精進行處理。
(3) 可加入5ml甘油(丙三醇),以防固定液蒸發和材料變硬。
(4) 此液兼有保存劑作用,故常采用。
2. FPA固定液固定時用丙酸代替冰醋酸,三種成分的用量同FAA,制片效果有時較FAA好。
3. CanoysFluid(卡諾氏液)
適用范圍:穿透力迅速,常用于細胞學如根尖、花藥的壓片及子房石蠟切片等。
固定時間:根尖、花藥可固定15分鐘至30分鐘,其他材料不超過24小時。
材料固定后,用95%、85%酒精浸洗,每級約20分鐘,然后轉入70%酒精中保存備用。
實驗步驟
1. 殺生(殺死):在制片過程中,將擬制片的材料(細胞或組織塊)迅速殺死,使組織塊盡量保持原生活時狀態,這種處理通稱殺生。殺生時常用一種或多種化學藥品處理。一般以滲透力較強的藥劑作殺生劑效果較好。
2. 固定:在殺生處理的過程中,將器官、組織、細胞按原來的形態保存下來,并為后續制片保持固有形態,這樣才達到固定的要求。殺生與固定關系密切,通常二者兼有作用。
3. 保存:組織塊經殺生固定后,能較長時間保存下來,經久保存下來的組織塊,仍能制片,如酒精、醋酸、福爾馬林液保存時間較長,而鉻酸類固定液,常須轉換70%酒精液后保存,才可較長時間保存。
每種殺生與固定液都有其優缺點。有些殺生劑透入迅速,有些透入較慢,又有些透入雖快而會損害組織,為此人們在實踐中常加其他藥劑調節,或用水沖洗等,以彌補其不足。
在材料開始處理脫水前,需將組織塊中含固定液沖洗掉,以便后續處理順利進行。通常沖洗法如下:
(1) 流水沖洗法:將醫藥用塑料小瓶,用燒紅(酒精燈)了的解剖針,刺成無數小孔(孔的大小,由材料的大小決定),或剪去眼藥瓶(塑料)的底部,焊上尼龍紗。沖洗前將材料倒入制成的濾器內,固定液漏下丟棄,加另一塑料蓋,置廣口瓶或培養缸內,以流水沖洗(自來水龍頭上套一個連接頭,也是用塑料眼藥瓶剪去底部,再反裝水龍頭上,眼藥瓶細嘴的一端,連接一個橡皮管,后將橡皮管通入裝材料的瓶中,讓流水徐徐從瓶底向上沖洗材料)。
(2) 靜水洗滌法:如以酒精洗滌,或不能使用流水沖的材料(根尖、花藥等)則用連續換洗來達到清洗目的,每次換液只需提起濾器,傾去舊液,換進新液。這種洗滌法的優點是:①不會損壞組織材料,②省時間省藥品,提高工效和經濟效益。凡經水至各級酒精脫水至70%酒精級時,材料可保存備用。
固定時,往往采用殺生與固定同時作用的混合固定液,其中藥品常具平衡作用,如甲種藥劑使細胞皺縮,加乙種藥劑使其細胞膨脹,這種平衡固定液才宜使用,若兩者對組織都不利,則一定不可采用,另對易氧化的藥物不要與其他物質混合,因其還原力強,常使固定液發生變化而影響材料的固定,固定前材料存放器皿要根據材料大小性質進行選用。
注意事項
1. 要注意固定目的物本身的結構性質,以便選用適合的固定液,如一般根、莖、葉的組織切片用FAA,根尖、花藥壓片材料用卡諾民固定液,花藥胚囊用納瓦申(Navashin’s)液,莖尖(根尖)用鉻酸-醋酸液。另外,固定時間的長短,要根據材料的特點而增減。
2. 固定微小材料可直接投入固定液中,對于較大材料,則須將其先解剖成較小材料,迅速投入固定液,以完成殺生固定作用。
3. 當體積較大的材料,出現外部已超過固定作用,而內部仍未達到固定目的時,必須考慮用透入快的固定液,如醋酸酒精或苦味酸蟻醛混合液。另外,加用超聲波發生器處理數分鐘,能達到迅速殺生的目的。
4. 對多毛的芽或根莖(菊科有的芽)固定時,須先投入醋酸酒精被中浸數分鐘,然后再入納瓦申液或其他固定液中,完成其固定作用,與此同時,還須進行抽氣。另可用超聲波發生器進行抽氣固定。
5. 要考慮固定影像問題。一般固定液固定影像有兩種類型。酸性固定影像對染色質、細胞核、紡錘絲等能保存,而對細胞質、核質、線粒體則溶解。鹽基性固定影像對問期的染色質、紡錘絲溶解核質、線粒體則保全。
一般固定液多為酸性固定影像,鹽基性固定影像較少。影像的形成并不完全按固定液的性質產生。同一種固定液,有時因材料的不同其影像有差異,因此,除考慮影像外,還應在脫水劑、滲入劑方面進行觀察,適當選擇,如同一種材料,用純酒精與二甲苯脫水透明和用三丁醇脫水透明,兩者所產生的影像是不相同的。
6. 固定劑的濃度,也是不可忽視的條件。
7. 材料的標記。固定標本瓶上,必須貼以標簽,用碳素墨水書寫以下內容:編號、采集時間、地點、處理者的姓名簡寫。另外,還需記采用何種固定液、何種保存液等內容。