| 實驗步驟 | 一、材料
1. 母體植株的生長
( 1 ) 將母體植株種植于 12 , 7F ( 直徑為 13 cm) 的盆缽中，每盆 4 株。
( 2 ) 用 Levingtons M2 培養土，并施用 5 g/L 奧綠專用緩釋肥（15 : 9 : 9+ 3 MgO + TE；釋放周期達 5~6 個月），并在介質表層鋪一薄層蛭石。
( 3 ) 用 Teku 植物支撐器（LBS Horticulture Colne Lancashire, UK) 來支撐植株。
( 4 ) 托盤中鋪上 Aquamat ( LBS Horticulture)，每盤放 6 罐（底部寬 30 cm、長 50 cm 的深礫石托盤）。
( 5 ) 由 Octamitters 控制澆水。
( 6 ) 所使用的生長箱是 Conviron PGV/PGW 36。
2. 小量甘油農桿菌制備法
需要準備以下材料：
( 1 ) LB 培養基（Sigma- Aldrich)
( 2 ) 通用型試管（25 mL，Sterilin)
( 3 ) 85 : 15 的 LB 培養基/甘油溶液（Sigma- Aldrich)
3. 農桿菌制備及接種
需要準備以下材料：
( 1 ) YEP 固體培養基：5 g/L 酵母提取物，10 g/L 蛋白胨，5 g/L NaCl，15 g/L 瓊脂，pH 6.8（以上均購自 Sigma- Aldrich) 。
( 2 ) TSIM 培養基：4.4 g/L MS 鹽和維生素（MP Biomedicals) , 100 mg/L 肌醇，10 g/L 蔗糖，500 mg/L MES 緩沖液（以上均購自 Sigma- Aldrich)，pH 5.2，過濾除菌。
( 3 ) 乙酰丁香酮（3 ,5 -diphenoxy- 4- hydroxyacetophenone) ( Sigma- Aldrich) ，0.1 mol/L 水溶液。
( 4 ) 25 μl 至 2.5 ml Hamilton 可重復使用的注射分液器（圖 7.1)。
( 5 ) Hamilton 注射器（50 μl），帶針頭。
( 6 ) 量筒（500 ml)
( 7 ) 玻璃棒或類似的支持物
( 8 ) 透明塑料袋（455 mmx 600 mm)
( 9 ) Sanyo 多功能環境監測箱
4. 組織培養
需要用到以下材料：
( 1 ) Domestos 漂白劑（Lever Bros)
( 2 ) 乙醇溶液（70% V/V)：以去離子水配制
( 3 ) 無菌去離子水
( 4 ) 帶 15 號刀片的手術刀（Swann-Morton，Sheffield，UK)
( 5 ) W4 培養基：4.4 g/L MS 鹽和維生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) ，2 mg/L 2，4-D，鈉鹽（Sigma- Aldrich) ，500 mg/L 谷氨酰胺（Sigma-Aldrich) , 100 mg/L 酪蛋白水解物（Sigma-Aldrich) ，6 g/L 1-A 型瓊脂糖（Sigma-Aldrich) ，150 mg/L 特美汀 ( ticarcillin disodium/potassium clavulanate) ( Melford Laborato ries Ipswich, UK)，pH 5.8 。表 7.1 列出了培養基添加劑的制備細節。
( 6 ) W425G 培養基：其余同 W4 培養基，額外加入 25 mg/L G418，重硫酸鹽 ( Sigma-Aldrich )。
( 7 ) MRM 培養基：4.4 g/L MS 鹽和維生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA, Germany) ，6 g/L 1-A 型瓊脂糖（Sigma- Aldrich)，2 mg/L 激動素 ( SigmaAldrich)， pH 5.8 。
( 8 ) MRM25G 培養基：其余同 MRM 培養基，額外加入 25 mg/L G418，重硫酸鹽 ( Sigma- Aldrich) 。
( 9 ) Beatson 廣口瓶（250 ml，Richardsons, Leicester, UK) 以有蓋培養皿的底作為蓋子，并以 25 mm 3M Micropore 的膠帶封口。
( 10 ) MS20 培養基：4.4 g/L MS 鹽和維生素（同前）， 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) , 7 g/L 經植物細胞培養測試過的瓊脂（Sigma- Aldrich)，pH 5.8 。
( 11 ) Sanyo 多功能環境監測箱。
5. 轉基因幼苗的生長
需要用到以下材料：
( 1 ) Jiffy 7 泥炭顆粒（Jiffy 產品， Norway)
( 2 ) 播種托盤及相應的 24 孔穴盤（可任選供應商）
( 3 ) 適合播種盤大小的培養箱（可任選供應商）
6. 轉基因植株的生長
需要用到以下材料：
( 1 ) 12F（直徑 12 cm）盆缽，每盆種一株。
( 2 ) 用 Levingtons M2 的混合肥培養植株，并施以 5 g/L 奧綠專用緩釋肥（同前）
( 3 ) 用 Pea sticks/split canes 作為支撐物。
( 4 ) 微孔面包袋（Focus Packaging) 用于套袋。
二、方法
1. 母株的生長
( 1 ) 將種子播至施有緩釋肥的 M2 混合肥中（同上），深度為 2~3 cm ( 每罐 4 顆）。
( 2 ) 在盆的表層鋪一薄層蛭石，以保持表層混合肥的質量。每罐放一個 Teku 植物支持器。
( 3 ) 把盆栽放在 Conviron 生長箱里，培養條件是白天 20℃、夜晚 15℃，16 h 光周期，400 μE/( m2·s ) 的光照（見注 1)。
2. 收獲
( 1 ) 開花 16~18 天后收獲分蘗，此時胚長至 1 mm 大小。從植株基部剪掉分蘗（見注 2 ) 。
( 2 ) 棄去底部的葉片，保留劍葉。
( 3 ) 將分蘗立即放入裝有水的 500 ml 量筒中，修剪分蘗的長度以使劍葉正好位于量筒的頂部。
3. 脫粒
( 1 ) 去除每穗底部 2~3 個小穗。
( 2 ) 從下往上選取第一和第二朵花（圖 7.2 ) ，小心地從花上去除穎片和外稃，僅使這兩朵花的未成熟種子暴露出來。
( 3 ) 剪去干擾接種的殘余組織，即未動過的花（如第三、第四朵花等）的外稃/穎片及芒，切忌損傷裸露的種子，否則會導致共培養時真菌的污染。
( 4 ) 用軟刷向上刷穗以去除花藥，否則也可能引起真菌生長。
( 5 ) 用濕紙巾擦拭葉片。
( 6 ) 輕輕地用 70%（V/V）乙醇噴穗部，使其在接種前干燥（見注 3) 。
4. 制備農桿菌平板
( 1 ) 制備少量含有質粒的甘油農桿菌。
( 2 ) 從母板上挑取一個單克隆，在加有相應抗生素的 LB 培養基 [ 16 ] 里，28℃ 劇烈振蕩培養過夜。取 1 ml 到 Eppendorf 管中，10000 g 離心 30 s。去上清，并用 1 ml 加有 15%（m/V）甘油的 LB 重懸細胞。分裝成小份，在 -80°C 保存。每次接種用一份新的甘油農桿菌，使用后棄之。
( 3 ) 接種實驗前，用保存的甘油農桿菌在含有相應抗生素的 YEP 平板上劃線，使整塊平板上長滿菌斑。
( 4 ) 封板，28℃ 培養 1 天，或者室溫培養 3 天。
5. 農桿菌重懸
( 1 ) 用于接種的麥穗準備好之后，開始制備農桿菌的懸浮液。
( 2 ) 用乙醇擦拭并燒灼一個平頭鏟，使之充分冷卻下來。
( 3 ) 用刮鏟輕輕刮平板的表面來收集足量細菌，然后轉移到含有 10 ml TSIM 和 400 μmol/L 乙酰丁香酮的 25 ml Universal 管中。應避免帶上平板上的膠，因為這會影響接種過程。
( 4 ) 用 1 ml 的 Gilson 移液槍反復吹打重懸細菌，直到變為均勻的懸濁液。
6. 接種
( 1 ) 用 70%（V/V）乙醇對注射器進行消毒處理 4~5 次，然后用無菌水沖洗 4~5 次。確保針孔朝向自己。
( 2 ) 用注射器吸取農桿菌懸浮液。
( 3 ) 手握住穗部，使針尖可以接觸到種子的胚。把針放入穗部使針尖大約位于胚乳和盾片的接合部（圖 7.3)。盾片輕微的損傷不會產生影響，而且可作為正確接種的證據。
( 4 ) 每次緩慢按下按鈕注射 1 μl 懸浮液。50 μl 的注射器，每按一次按鈕注射 1 μl 懸浮液。
( 5 ) 對所有外露的種子重復這一過程。
( 6 ) 在所有穗都接種后，在量筒中放一個支持物（如玻璃棒），然后用透明的塑料袋覆蓋并在底部封口。讓其在 22°C、16 h 光周期、40 μE/( m2· s) 光照條件下生長 2~3 天（見注 4 ) 。
( 7 ) 用 70%（V/V）乙醇清洗注射器 4~5 次，用無菌水沖洗 4~5 次，再用 70% 乙醇洗一次，然后晾干。
7. 隔離
( 1 ) 接種 2~3 天后，將種子從穗上取下放入適合的有蓋容器中。
( 2 ) 對種子進行表面消毒：70%（V/V）乙醇 1 min，20%（V/V）Domestos 漂白劑溶液 25 min，期間要攪拌。
( 3 ) 在濾網中用無菌去離子水徹底清洗。
( 4 ) 分離胚，然后放入 W4 培養基中，盾片向上，每皿放 25 個（見注 5) 。
( 5 ) 用 Parafilm 膜密封平板，然后在 28℃、16 h 光周期、80 μE/(m2·s) 光照條件下培養 5 天。
8. 組織培養
( 1 ) 5 天后，將胚軸從盾片上切除（見注 6 ) ，然后轉移到新鮮的 W4 培養基上（見注 7) 。
( 2 ) 培養 12 天后，將愈傷組織移到選擇培養基上（W4 25G ) 。在 25℃、16 h 光周期、80 μE/(m2·s) 光照條件下培養 2 周（接下來的操作都在這一溫度和光照條件下進行）。
( 3 ) 選擇 2 周后，將愈傷組織分成小塊以便更好地接觸到選擇培養基，然后移到新鮮的 W4 25G 培養基上。
( 4 ) 繼續選擇培養 2 周后，將有活力的胚性愈傷移到含有選擇試劑的再生培養基上( MRM 25 G)。 2 周后再進行一次轉移，將還未發育成芽的愈傷移到新的 MRM 25G 培養基中。
( 5 ) 將再生的芽移到含有 MS20 的 Beatson 罐，然后讓其在 25℃ 下培養（見注 8) 。
( 6 ) 讓芽生長大約 1 個月，在這期間葉和根應該發育完全。
9. 土壤移植和煉苗
( 1 ) 用自來水濕潤 Jiffy7 泥炭丸并放置于 24 孔穴盤中，將穴盤放到培植箱中。
( 2 ) 從 Beatson 罐中把苗移出，避免根部帶上瓊脂。
( 3 ) 將叢生的苗分開直至每一株苗只有一個芽。
( 4 ) 將苗移到 Jiffy 7 泥炭丸中，確保所有的根被 Jiffy 包埋，使得根能夠接觸到泥炭。去掉死的和將死的葉片。將生長中的葉片修整到 5~10 cm。在重新蓋上培植箱蓋前撒點水（見注 9 ) 。
( 5 ) 在 20℃ 生長 2 周后，如需要，植株可以用來做 PCR 檢測和盆栽（見注 10)。
( 6 ) 為獲得最大的產量，可將苗移到帶 M2 培養土的 12F 罐 中（ 見上），每罐一株苗。在將苗轉移到土壤的過程中不要去除 Jiffy 泥炭丸外的網以保持泥炭丸的完整。
( 7 ) 將開花的植株套袋以減少花粉的傳播。 展開 |
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