植物葉蛋白的提取實驗步驟

鴨源性核酸PCR-熒光探針試劑盒植物葉蛋白的提取主要有鹽析法、有機溶劑沉淀法、加熱法(含逐步和快速加熱)、 離心分離法、結晶和重結晶法等。依據今后的開發方向(以飼料為基礎，以食品、飲品為開發方向)及簡便易行和使用的原則，主要采用鹽析法、加熱法和有機溶劑法分離提取葉蛋白(冷提和熱提)。不同的提取方法，對樣品的處理方式、程度和要求不同，結果也有差異。

(一)改良丙酮沉淀法提取葉蛋白

取0.3g 左右的植物葉片，用液氮研磨，色素多的可按材料鮮重的10%加入PVP，并將充分研磨過的樣品轉入離心管中，加入4mL 的提取緩沖液，搖勻并放在4℃條件下提取1h，充分溶解蛋白。放置后的樣品充分搖勻，4℃10000r/min 離心30min，棄沉淀，上清液中加入2.5～3倍體積的村-20℃條件下，讓蛋白充分沉淀。之后，4℃10000r/min 離心30min，其上清，沉淀置于-20℃下，使丙酮完全揮發，如有必要加入上樣緩沖液溶解沉淀。緩沖液用量300ul，沉淀充分溶解后，轉移至1.5mL 離心管中，4℃12000r/min 離心15min ，取上清液即為所提取的葉蛋白溶液。

鴨源性核酸PCR-熒光探針試劑盒該方法提取的蛋白質，提取效率高，雜質干擾少，電泳結果蛋白條帶清晰，數量多。

(二)植物葉片總蛋白的提取—三氯醋酸—丙酮沉淀法

①在液氮中研磨適量的葉片;

②懸浮于含10%的三氯醋酸和含0.07%β-巰基乙醇(可用DTT 代替)的丙酮溶液在-20℃條件下冰浴;

③讓蛋白質沉淀后離心(4℃ 10000r/min 離心30~60min)，棄上清;

④重懸沉淀浮于含0.07%β-巰基乙醇的預冷丙酮溶液中;

⑤離心(同上)后真空干燥沉淀;

⑥用上樣緩沖液溶解沉淀，離心;

⑦Brandford 法定量蛋白，然后分裝至Eppendof 管中保存在-78℃備用。

(三)鴨源性核酸PCR-熒光探針試劑盒分步提取可溶性葉蛋白

(1)蛋白質浸出 ①水溶性蛋白質浸出：用0.05molpH7.0的磷酸緩沖液(或蒸餾水)將樣品制成勻漿液，然后離心15min(4000r/min)，收集上清液即蛋白質浸出液，再將沉淀物按上述操作重復兩次。②鹽溶性蛋白質浸出用10%NaCl 將前者剩余沉淀物分離提取兩次，收集蛋白質浸出液。

(2)蛋白質沉淀用0.1mol 醋酸將蛋白質浸出液pH 值調至蛋白質等電點(pH4.5左右)，即8體積蛋白質浸出液加入1體積0.1mol 醋酸，混勻，離心15min(3000r/min)，棄去上清液，沉淀物即為可溶性葉蛋白。

(3)蛋白質收集于沉淀物中加入95%乙醇，混勻，用定量濾紙過濾或抽濾，待風干后收集。

(四)沉淀法提取葉蛋白

取0.3g 植物葉蛋白，用液氮充分研磨轉入離心管中，加入3mL 提取緩沖液，搖勻并放在4℃條件下提取1h，充分溶解蛋白后，4℃10000r/min 離心20min，棄沉淀，上清液中加入(NH4)2SO4 ，混勻1h，按1：2(v/v)加入-20℃預冷的80%丙酮，混勻后4℃12000r/min 離心10min，沉淀在-20℃冰箱中放置20min，使丙酮完全揮發后加適量上樣緩沖液，待沉淀充分溶解后，4℃12000r/min 離心5min，取上清液即為所提取的葉蛋白溶液。