植物組織中丙二醛含量的測定

實驗概要

植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產物，從膜上產生的位置釋放出后，與蛋白質、核酸起反應修飾其特征；使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質的合成。MDA的積累可能對膜和細胞造成一定的傷害。

實驗原理

丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮），其最大吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應產物的最大吸收波長在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中MDA—TBA反應物質含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應物在532、450nm處的消光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100～300μg/g DW，根據植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3＋的終濃度為0.5μmol/L。
 

A. 直線回歸法

    MDA與TBA顯色反應產物在450nm波長下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖（0～25mmol/L）與TBA顯色反應產物在450nm的消光度值與532nm和600nm處的消光度值之差成正相關，配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應后，測定上述三個波長的消光度值，求其直線方程，可求算糖分在532nm處的消光度值。UV-120型紫外可見分光光度計的直線方程為：

Y532＝﹣0.00198＋0.088D450      ① 
                                   

B．雙組分分光光度計法

據朗伯-比爾定律：D＝kCL，當液層厚度為1cm時，k=D/C，k稱為該物質的比吸收系數。當某一溶液中有數種吸光物質時，某一波長下的消光度值等于此混合液在該波長下各顯色物質的消光度之和。
 

    已知蔗糖與TBA顯色反應產物在450nm和532nm波長下的比吸收系數分別為85.40，7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數為0，532nm波長下的比吸收系數為155，根據雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式：

C1(mmol/L)=11.71D450                                      ②

C2(μmol/L)=6.45(D532－D600)－0.56D450         ③

式中  C1－為可溶性糖的濃度；

C2－為MDA的濃度；

D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的消光度值。

主要試劑

10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氫氧化鈉（1mol/L）溶解，再用10％的三氯乙酸定容；石英砂。

主要設備

紫外可見分光光度計1臺；離心機1臺；電子天平1臺；10ml離心管4支；研缽兩套；試管4支；刻度吸管：10ml 1支，2ml 1支；剪刀1把。

實驗材料

受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官

實驗步驟

    1. 實驗材料  受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。
 

    2. MDA的提取  稱取剪碎的試材1g，加入2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml TCA進一步研磨，勻漿離心（4000×g）10min，上清液為樣品提取液。
 

    3. 顯色反應和測定  吸取離心的上清液2ml（對照加2ml蒸餾水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的消光度。
 

    4. 計算含量

    (1) 直線方程法  按公式①求出樣品中糖分在532nm處的消光度值Y532，用實測532nm的消光度值減去600nm非特異吸收的消光度值再減去Y532，其差值為測定樣品中MDA-TBA反應產物在532nm的消光度值。按MDA在532nm處的毫摩爾消光系數為155換算求出提取液中MDA濃度。
 

    (2) 雙組分分光光度法  按公式③可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。

    用上述任一方法求得MDA的濃度，根據植物組織的重量計算測定樣品中MDA的含量：
 MDA（μmol/g FW）＝ (MDA濃度(umol/L)*提取液體積(ml))) / 植物組織鮮重(g)

注意事項

1. 0.1-0.5%的三氯乙酸對MDA—TBA反應較合適,若高于此濃度,其反應液的非專一性吸收偏高;
 

2. MDA-TBA顯色反應的加熱時間,最好控制沸水浴10-15min之間.時間太短或太長均會引起532nm下的光吸收值下降; 
 

3. 如待測液渾濁,可適當增加離心力及時間,最好使用低溫離心機離心.
 

4. 低濃度的鐵離子能增強MDA與TBA的顯色反應,當植物組織中鐵離子濃度過低時應補充 Fe3 (最終濃度為0.5 nmol·L-1)
 

5. 可溶性糖與TBA顯色反應的產物在532 nm也有吸收(最大吸收在450 nm),當植物處于干旱,高溫,低溫等逆境時可溶性糖含量會增高,必要時要排除可溶性糖的干擾.

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