植物組織培養技術知識匯總（一）

人們利用植物  組織培養技術快速獲取優良植物株系、培育作物新品種等方面，那么如何利用植物組織培養技術再生植株呢?如何鑒定與避免與植物組織培養苗的污染，在此，小編總結了有關植物組織培養技術的七大方面，帶你領略植物組織培養技術的方方面面。

第一部分 植物組織培養的概念

(廣義)又叫離體培養，指從植物  體分離出符合需要的組織.器官或細胞，原生質體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養以獲得再生的完整植株或生產具有經濟價值的其他產品的技術。

(狹義)組培指用植物  各部分組織，如形成層.薄壁組織.葉肉組織.胚乳等進行培養獲得再生植株，也指在培養過程中從各器官上產生愈傷組織的培養，愈傷組織再經過再分化形成再生植物。

植物  組織培養基礎理論

1、植物  細胞全能性

植物細胞全能性(totipotency)是組織培養的理論基礎。一個生活的植物細胞，只要有完整的膜系統和細胞核，它就會有一整套發育成一個完整植株的遺傳基礎，在一個適當的條件下可以通過分裂、分化再生成一個完整植株，這就是所謂的細胞全能性。

但是在自然狀態下，由于細胞在植物體內所處位置及生理條件的不同，它的分化受到各方面的調控，致使其所具有的遺傳信息不能全部表達出來，所以只能形成某種特化細胞，構成植物體的一種組織或一個器官的一部分。

由此可以說明條件是十分重要的，或者說是關鍵的，只要條件合適，細胞潛在的遺傳能力就會表現出來。植物組織和細胞培養技術就是以細胞全能性作為理論依據，用人為的方法創造出一個適合于生長的理想條件，使細胞的全能性得以發揮。

從理論上講，只要是一個生活的細胞，都有再生出一個完整植株的潛力，但實際情況并非如此簡單。就目前所知，細胞的再生潛力與其分化程度呈負相關，就是說細胞分化程度越高其再生能力越低，但也有人認為細胞的再生能力與其分化程度無關，只是人們現在還沒能完全掌握細胞分化的機制。

雖然還沒有完全從理論上揭示其原因，但事實是越老的細胞，其基因的表達就越受到嚴格的制約，或者說喪失功能或不表現功能的基因越多，所以應盡量選取幼嫩的植物組織作為培養的實驗材料。

同時，還應該考慮到，一定的基因型或外植體的再生能力并不是一成不變的，在不同培養條件下，同一基因型或外植體的表現不同，高度分化的細胞或組織只要條件合適，也有產生再生植株的可能，這種可能性能否變成現實，還有待于人們繼續努力。

2、細胞分化、脫分化與再分化

(cell differentiation,didifferentiation and ridifferentiation)

一粒成熟的種子含有一個小小的胚，也可以叫做胚胎。構成胚胎的所有細胞幾乎都保持著未分化的狀態和旺盛的細胞分裂能力，其細胞質濃稠，細胞核較大，細胞與細胞之間沒有很大差異，這些細胞都可以叫做胚性細胞，或叫分生性細胞或未分化細胞。在適宜的條件下，隨著種子的萌發，構成胚胎的所有細胞即開始分裂活動，增加細胞數目。

隨著時間的進行細胞的命運發生不同變化，形態和功能也發生變化，有的形成了葉子的細胞，有的形成了根的細胞，有的形成莖的細胞，有的仍保持分裂能力，有的則逐漸失去分裂能力，細胞的這種在形態結構和功能上發生永久性(不可逆轉性)適度變化的過程叫做分化。

分化主要是由細胞內的基因決定的，也就是說分化是基因在時間和空間兩個方面差次表達的結果。分化的結果導致細胞分裂能力的喪失，伴隨的是細胞的分化、成熟與組織的形成，是植物根、莖、葉、花、果實和種子的形成，是一個成熟植物體的出現。

在正常的自然狀態下，這些已經分化的細胞不會再恢復分裂能力重新開始細胞分裂，直到植物體死亡為止。

當把一個已經失去了分裂能力，處于分化成熟和分裂靜止狀態的細胞置于特定的增殖培養基上時，它首先發生的變化是回復到分生性狀態，這一狀態包括由溶酶體的活動而將失去功能的細胞質組分降解，并產生新的細胞質組分(即細胞器的破壞與重建)，同時細胞內酶的種類與活性發生改變，蛋白質合成和細胞代謝過程也發生改變，最后引起基因表達的改變，細胞的性質和狀態發生了扭轉，可以說是返老還童。

由失去分裂能力的細胞回復到分生性狀態并進行分裂，形成無分化的細胞團即愈傷組織的現象(或者說是過程)稱為“脫分化”(dedifferentiation)。經過脫分化的細胞如果條件合適，就可以長久保持旺盛的分裂狀態而不發生分化。

由無分化的愈傷組織的細胞再轉變成為具有一定結構，執行一定生理功能的細胞團和組織，構成一個完整的植物體或植物器官的現象(或過程)，叫做“再分化”(redifferentiation)。

一個已分化細胞要表達出其全能性，就要經過脫分化和再分化的過程，這就是植物組織和細胞培養所要達到的目的。設計培養基和創造合適培養條件的主要原則就是如何促使植物組織和細胞完成脫分化和再分化，培養的主要工作就是設計和篩選培養基，探討和建立合適的培養條件。

植物激素在調節細胞脫分化和再分化中起到主要作用。植物對激素的反應十分敏感，培養基中生長素類和細胞分裂素類的種類、相對比例和絕對量都能直接影響到細胞脫分化和再分化的過程，組培中常常是通過調節激素的種類、濃度和相對比例來達到調節脫分化和再分化的目的。

3、器官發生和胚狀體發生(organogenesis and embryogensis)

培養的植物組織與細胞再經過脫分化和再分化再生出新的植物體過程中，特別是再分化時，可經過兩條途徑，一是由愈傷組織的部分細胞先分化產生芽(或根)，再在另一種培養基上產生根(或芽)，形成一個完整的植株，因為芽和根都是植物體的器官，所以這一過程叫器官發生途徑。

另一個是在愈傷組織中產生出一些與種子中的胚相似的結構，即同時形成一個有苗端和根端的兩極性結構，然后再在另一種培養基上同時發展成帶根苗，由于這一過程與種子中胚的形成和種子萌發時形成幼苗的過程相似，所以叫做胚狀體發生或無性胚胎發生。

組培條件下，植物再生是走器官發生途徑還是走胚狀體途徑，隨植物不同而不同，也隨培養基的不同而變化，有時甚至同一種植物在同一條件下，即存在體細胞胚胎發生途徑，也存在器官發生發生途徑，這都是自然現象，是正常的，只是兩種發育途徑的頻率隨著基因型不同和培養條件的改變而差異顯著。

第二部分 植物組織培養培養基成分組成

化學合成培養基大致由6種成分組成：

(1)糖類，

(2)多種無機鹽類，

(3)微量元素，

(4)氨基酸、酰胺、嘌呤：

(5)維生素;生長素。

此外，有些培養基還可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麥芽浸出液等，培養基中如加入0.5～1%的瓊脂即為靜止培養的固體培養基，否則為懸浮培養的液體培養基。

不同植物材料常需要改變配方，如維持生長和誘導細胞分裂和分化的培養基配方就不同，因此配方的種類很多，目前以Ms (Murashige and Skoog)培養基配方為最常用的一種基本培養基，它利于一般植物組織和細胞的快速生長。

在進行組織培養研究時應根據研究目的和培養植物的種類來確定培養基的組成，除營養、誘導作用外還應當注意離子平衡和毒性問題，如水一般都采用重蒸餾水，無機鹽類一般都需用化學純的藥品， pH值可用1N KoH(或NaOH)溶液和2N HCI調整。

有時可以用普通藥品代替，但須注意這些藥品不僅應有營養價值，還須無毒。如果在工業上使用大缸深層培養細胞或組織生產有效成分和生物制品、應用培養基的量將要以噸位計量時，則采用什么代用品較為經濟實用更應慎重考慮。

第三部分 植物組織培養的培養條件

(一)溫度： 對大多數植物組織20～28℃即可滿足生長所需，其中26～27℃最適合。

(二)光： 組織培養通常在散射光線下進行。光的影響可導致不同的結果。有些植物組織在暗處生長較好，而另一些植物組織在光亮處生長較好，但由愈傷組織分化成器官時，則每日必須要有一定時間的光照才能形成芽和根。有些次生物質的形成，光是決定三因素。

(三)滲透壓： 滲透壓對植物組織的生長和分化很有關系。在培養基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質可以調整滲透壓。通常1～2個大氣壓可促進植物組織生長，2個大氣壓以上時，出現生長障礙，6個大氣壓時植物組織即無法生存。

(四)酸堿度： 一般植物組織生長的最適宜pH為5～6.5。在培養過程中pH可發生變化，加進磷酸氫鹽或二氫鹽，可起穩定作用。

(五)通氣： 懸浮培養中細胞的旺盛生長必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養時巨常轉動或振蕩，可起通氣和攪拌作用。大量培養中可采用專門的通氣和攪拌裝置。

第四部分 植物組織培養材料與方法

從低等的藻類到苔蘚、蕨類、種子植物等高等植物的各類、各部分都可采用作為組織培養的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韌皮部細胞，被子植物采用胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉、花藥、花粉、子房和胚珠等各個部分。

由于植物在自然條件下，表面常被霉菌和細菌污染，故材料必須進行滅菌處理。一般用漂白粉溶液(1～10%)、次氯酸鈉溶液(0.5～10%)、升汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或過氧化氫(3～10%)等處理后，再用無菌水反復沖洗至凈，然后在無菌室內，將所取的組織迅速培養在固體培養基上。

在適宜的條件下，受傷組織切口表面不久即能長出一種脫分化的組織堆塊，稱為愈傷組織(Callus)，此種愈傷組織在適當的培養基上經一定時間即能誘導生長成整株植物，因此愈傷組織既可是某種植物代謝產物的來源，又是誘導成株的主要途徑之一。

在適宜的培養條件下，還可使愈傷組織長期傳代生存下去，這種培養稱為繼代培養。

但在繼代培養中，不少植物培養的組織或細胞隨著再培養代數的增加，分化能力就逐漸降低甚至喪失，其原因可能是由于在培養過程中原有母體中存在的、與器官形成有關的特殊物質被逐漸消耗所致。

因此可以用激素或改善營養條件使之恢復，也有認為是組織和細胞在長期培養中遺傳往的改變，主要是染色體的變化，出現大量多倍性或非整倍性細胞，這種改變恢復的可能住較小。

不同的培養基可以使愈傷組織具有不同的生長速度，結構也可松可緊，利用這些特性可使之分散成為單細胞或很小的細胞團。要形成單細胞培養宜在較高鹽分、高生長素及高水解酪蛋白的培養基中進行，然后移入液體并經攪拌而分散成單細胞。

也有用加入一些果膠酶的辦法，但一般來說要得到純一的單細胞是很少的。

在培養藥用植物選材時，還應考慮到所需要的次生物質在植物體中的合成部位，如果選材和培養方法適當，可使原植物內所產主的代謝物通過細胞或組織培養發生生化轉變而獲得。

通過組織培養可獲得有效成分，但實際上只有大量培養成功才有經濟價值。因此在生產上常采用懸浮培養法來代替含有瓊脂的固體培養基。

愈傷組織懸浮培養的生長通常比靜止培養快，這是由于懸浮培養時營養成分可較快地滲入細胞，抑制生長的代謝廢物可較快地除去，同時供氧情況也較好，在進行這種培養時要注意通氣與定期更新營養液，這是保證生長穩定，次生物質產量高的關鍵之一。

第五部分 植物組織培養再生的步驟

一、接種

組織培養的接種是指將滅過菌的材料，在無菌的情況下，切成小塊，放入培養基的過程。科研、生產部門的接種工作，多在無菌室或超凈工作臺上進行，中學可制作接種箱，在箱內進行接種。接種的方法步驟如下：

1、在無菌室或接種箱中放好接種時所需要的酒精燈、貯存70%酒精和棉球的廣口瓶、各種鑷子、接種針、解剖刀、手術剪、火柴、培養基等。

2、在無菌室或接種箱內用紫外燈滅菌(無菌室照射20～50分鐘，接種箱照射15分鐘)。

3、放入已滅菌的接種材料(用培養皿盛取)。同時，操作人員用酒精棉球擦手，并對接種工具用酒精燈火焰燒灼。

4、用手術刀片將材料切割成若干片段，并迅速接種入培養基中。接種時，錐形瓶(或試管)應斜向火焰，在酒精燈火焰附近操作。

5、材料接種好后，將錐形瓶瓶口在酒精燈火焰上轉動燒一遍，蓋好瓶蓋，注明材料名稱及接種日期。

材料接種后，應置于26～28℃的培養室中進行培養。

二、植株誘導

本階段是組織培養中最重要的一環。在培養基中植物激素的作用下，外植體通過三條途徑迅速增殖，這就是側芽增殖、誘導不定芽的形成和誘導胚狀體的形成。

1、側芽增殖

種子植物的每個葉腋中通常都存在著腋芽，在一定條件下可以使它生長。現在知道頂端優勢抑制側芽生長，可被外源的細胞分裂素打破，所以在利用側芽增殖這條途徑時，培養基中幾乎都要加入細胞分裂素(有時也加入少量生長素)。

由于細胞分裂素的持續作用，側芽不斷分化和生長，逐漸形成芽叢。如果反復切割和轉移到新的培養基上繼代培養，就可在短期內得到大量的芽。 側芽增殖的主要優點是能保持遺傳的穩定性，因為莖尖的細胞常是均一的二倍體細胞，它不易受培養條件的影響而發生變異，也易于保持嵌合體的性狀。

目前已有近百種植物可以用這種方法進行繁殖，如草毒(Fragaria ananassa Duch.)、蘋果、葡萄(Vitis vinifera L.)、唐菖蒲(Gladiolus gandavensis Houtt.)、非洲菊、月季(Rosa chinensis Jacq.)、甜菜(Beta vulgaris L.)和鳳梨(Ananas comosus(L.) Merr.)等。

關于培養基中加入細胞分裂素的濃度，是0.1～10.0毫克/升，一般為1.0～2.0毫克/升。在幾種細胞分裂素中用的最多的是6-芐基嘌呤，其次是激動素和異戎基腺苷，玉米素用的很少。

除了細胞分裂素之外，在培養基中還經常加入低濃度的生長素以促進腋芽的生長。常用的生長素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸(濃度為0.1～1.0毫克/升)。

2、不定芽的誘導形成

在自然條件下，很多種植物的器官可以產生不定芽。在培養條件下，由于所需要的外植體很小又加上激素的作用，可以使這種產生不定芽的能力得到極好的發揮，如秋海棠或非洲紫羅蘭(Saintpaulia ionantha Wendl.)用常規的葉插法繁殖時，每片葉只能產生幾個到十幾個芽，但用葉切段在培養基中可產生成千上萬個芽。

在培養條件下，還能使自然條件下不產生不定芽的器官形成不定芽，如卷心菜(Brassica oleracea L.var.capi-tata L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的葉、菊花[Dendranthema morifolium(Ram.) Tzvel.]的花和葉片、百合(Lilium brownii F.E.Br.var.viridulum Baker)和水仙的鱗片以及萱草(Hemerocallis fulva L.)的花莖等。 在誘導外植體形成不定芽時，一般使用細胞分裂素高于生長素比值的激素配比，少數情況下也采用二者比值接近1的配比。

常用的細胞分裂素是6-芐基嘌呤，激動素和玉米素，濃度范圍一般在0.1～10.0毫克/升。生長素是萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸，其濃度范圍與細胞分裂素相同。為了使外植體形成不定芽，外源激素的供應只是一個方面，器官分化的性質還要決定于內源激素的狀況。

因此，對于不同的植物，使用的激素種類和濃度常有較大的變化。在具體操作時，應參考已有資料或相近種類的已有結果，以確定適當的濃度和配比。

3、胚狀體的誘導形成

在自然界只有少數植物可以由珠心產生胚狀體。在培養條件下，現在已有30多個科的150多種植物可以產生胚狀體。在誘導胚狀體的形成時，其外植體一般取自胚、分生組織或生殖器官。

為了獲得胚狀體，在培養過程中，培養基中應含有豐富的還原氮，并加入生長素(主要是2，4-D)誘導胚狀體的發生。待胚狀體發生后，要轉移到降低濃度或沒有生長素的培養基上進行培養，使胚狀體成熟和生長。

胚狀體途徑的優點是增殖率高，而且胚狀體既具胚芽又具胚根。因此，可免去生根這一步驟。但目前很多重要作物還不能形成胚狀體，或產生的胚狀體難以形成植株，另外胚狀體遺傳性也容易發生變異，所以目前除柑桔(Citrus)、油棕(Elaeis guine-ensis Jacq.)和咖啡(Coffea)等少數作物外，都不采用這一途徑。