實驗方法原理
分離線粒體DNA和葉綠體DNA的原理是基本一致的。本方法首先是分離完整的細胞器,然后從細胞器中提取DNA。要獲得高純度的細胞器DNA,關鍵是要把所要的細胞器與其他亞細胞結構分離開來,這可以通過差速離心或梯度離心來完成。完整的細胞器經裂解后,可以通過CsCl離心或酚-氯仿抽提獲得DNA。在裂解細胞器之前常用DNase清除非細胞器的DNA。本實驗采用勻漿法先將線粒體從細胞中分離出來,再使線粒體發生裂解,釋放出DNA、蛋白質等,經酚抽提后即可得到提純的mtDNA。
實驗材料 植物幼嫩葉片
儀器、耗材 研缽(直徑12cm)和研棒冷凍離心機(SorvallBeckman等)微型離心機(1.5ml管)-20℃冰箱恒溫水浴鍋
實驗步驟
以下所有操作除特別指明外,均在4℃進行,將研缽、研棒和離心管預冷,使用冷藏的緩沖液并在冰桶中操作。
1.剪取幼嫩葉片,用1%次氯酸鈉溶液消毒15min,無菌水沖洗3次,再將其剪成約1cm2的碎片。
2.按每克材料10ml研磨緩沖液的比例加入研磨緩沖液,在研缽中將葉片研磨成勻漿。用6層紗布過濾,并收集濾液。
3.濾液于4℃,3000r/min離心15min,收集上清液。
4.上清液于4℃,10000r/min離心25min,棄上清液。
5.沉淀用緩沖液A(不加β-巰基乙醇、BSA和PVP)懸浮,并重復4、5兩步驟,收集的沉淀即為粗線粒體。
6.加入MgCl2至終濃度為5mmol/L,加入DNaseⅠ至終濃度為30μg/ml,冰浴1h后加Na2EDTA至終濃度為15mmol/L以終止DNA酶解反應。
7.將粗線粒體鋪于不連續濃度的蔗糖梯度上(蔗糖濃度由上至下依次為20%、40%、52%、60%,體積依次為7ml、10ml、10ml、7ml,由緩沖液C配制)。4℃,20000r/min超速離心2.5h,吸取40%與52%蔗糖界面的線粒體。
8.在線粒體吸取物中加入4倍體積的緩沖液B。4℃,10000r/min離心15min。所得沉淀即為純凈、完整且表面無核DNA污染的線粒體。
9.將線粒體懸浮于裂解緩沖液中,加入1/10體積的10%SDS和1/100體積的30mg/mlRNase液,50℃水浴30min。
10.加入1/150體積的25mg/ml的蛋白酶K,37℃水浴30min。
11.依次用苯酚、苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿抽提DNA。
12.加1/10體積3mol/L乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇,混勻,-20℃放置至少30min,然后用微型離心機4℃、13000r/min離心15min,收集DNA。
13.沉淀DNA用75%乙醇洗2～3次。
14.DNA沉淀于空氣中干燥后溶于少量TE緩沖液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LNa2EDTA,pH8.0)中。-20℃保存備用。
注意事項
用于提取線粒體DNA的植物最好在黑暗條件下生長,得到黃化苗,以抑制葉綠體的發育,減少分離線粒體時葉綠體的干擾
其他
具體試劑描述：
緩沖液A(研磨緩沖液)(0.4
mol/L甘露醇,50 mmol/L Tris-HCl,1mmol/L Na2EDTA,5 mmol/L KCl,pH7.5;使用前加入2
mmol/L β-巰基乙醇,0.1%BSA,10 mg/ml聚乙烯吡咯烷酮),緩沖液B(0.2 mol/L甘露醇,10 mmol/L
Tris-HCl,1 mmol/L Na2EDTA,pH7.2),緩沖液C(1 mmol/L Na2EDTA,15 mmol/L
Tris-HCl,pH7.2),蛋白酶K(25 mg/ml),蔗糖(20%、40%、52%、60%),MgCl2(0.1
mol/L),DNaseI(2 mg/ml,溶于水),TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,1
mmol/LNa2EDTA,pH8.0),SDS(10%),RNase(30 mg/ml),乙酸鈉(3 mol/L),乙醇,苯酚,氯仿,異戊醇。