熒光是自然界常見的一種發光現象。熒光是光子與分子的相互作用產生的，這種相互過程可以通過雅布隆斯基(Jablonslc)分子能級圖描述：大多數分子在常態下，是處于基態的最低振動能級So，當受到能量（光能、電能、化學能等等）激發后，原子核周圍的電子從基態能級So躍遷到能量較高的激發態（第一或第二激發態），激發態的電子處于高能量狀態，不穩定，會通過兩種途徑釋放能量回到基態,一種是以光子形式釋放能量的輻射躍遷（包括熒光和磷光過程）,一種是以熱能等形式釋放能量的非輻射躍遷。通常原子核外電子受到激發從基態So躍遷到激發態Si后，會通過非輻射躍遷的方式快速降落在最低振動能級，隨后由最低振動能級回到基態，以光子輻射的形式釋放出能量，具有這種性質的出射光稱為熒光。
熒光成像的理論基礎是熒光物質被激發后所發射的熒光信號的強度在一定的范圍內與熒光素的量成線性關系。熒光成像系統包括熒光信號激發系統（激發光源、光路傳輸組件）、熒光信號收集組件、信號檢測以及放大系統（CCD、PMT）