實驗材料 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷
試劑、試劑盒 PP 緩沖液變性裂解緩沖液
儀器、耗材 微量滴定板
實驗步驟
3.1 高通量蛋白的表達和純化
我們用在 PQE30 表達載體里構建的，可表達帶 N 端 RGS-His6 標記的大腸桿菌 cDNA 表達克隆來生產重組植物蛋白。由于超出本章節的范圍，我們不在此詳細敘述這種表達克隆的產生過程，只是簡要地概括一下。從下列的 cDNA 表達庫中，我們也許能獲得以上所述的植物表達克隆：在表達載體 PQE30NST ( 檢索號：AF074376 ) 中構建的大麥表達庫和在 pQE30NAST attB 載體（檢索號：AF386205 ) 中構建的擬南芥表達庫。這些表達庫已經按照 Konrad Buessow 研究小組的方法，用脫氧胸腺嘧啶脫氧寡核苷酸作引物，生產具有完整 N 端的重組蛋白 [ 34~36] 。我們用全長擬南芥克隆作為植物蛋白表達克隆的另一個來源，這個全長擬南芥克隆是通過用基因特異引物限制性依賴克隆，或用 GATEWAY 克隆技術重組依賴性克隆，進行可讀框直接克隆獲得的。
為了從上述這些資源中高通量和小規模表達植物蛋白質，我們采用如下方法。
蛋白質表達
( 1 ) 在孔體積為 2 ml 的 96 孔深孔板上加滿附加了 2% 葡萄糖，100 μg/ml 氨芐青霉素和 15 μg/ml 卡那霉素的 100 μl 2YT 培養基。
( 2 ) 重組克隆培養物從之前保存在 -80°C 的 384 或 96 孔微孔板上接種出來，接種時要用 96 針復制器。
( 3 ) 培養物在 37°C 劇烈振搖（320 r/min ) 生長 16 h 后，加入 900 μl 預先加熱的培養基（1X SB 培養基，附加了 100 μg/ml 氨芐青霉素，15 μg/ml 卡那霉素，20 μg/ml 硫胺的 1X PP 緩沖液），然后繼續培養 2 h。
( 4 ) 為了誘導蛋白質表達，加入終濃度為 1 mmol/L 的 IPTG，并繼續培養 4~5 h。
( 5 ) 4°C，1500 g 離心 10 min，收集細胞，沉淀物于 -80°C 下保存。
( 6 ) 取出一部分收獲細胞的裂解產物在 15% 的聚丙烯酰胺凝膠上檢測蛋白質表達效率（圖 28-1)。
蛋白質純化
( 1 ) 首先，在解凍的沉淀物中加入 150 μl 的變性裂解緩沖液，劇烈渦旋振蕩溶解沉淀物，然后室溫下振搖（約 650 r/min) 孵育 30 min ( 見注釋2) 。
( 2 ) 1900 g 離心裂解細胞。上清液轉移到 96 孔濾板上（見注釋 3 )，并且用真空抽濾盒（vacuummanifold) 迅速吸入到一新鮮濾板上（見注釋 4 和注釋 5) 。
( 3 ) 接著在每個孔中加入 30 μl NiNTA-瓊脂糖（1 : 2 稀釋于裂解液中），用膠帶密封，室溫下，300 r/min 振搖 1 h，使組氨酸標記物與蛋白質結合。
( 4 ) 用 100 μl 的洗滌緩沖液重懸、洗滌瓊脂糖微球，振搖 5 min，重復 3 次，然后將上清液轉移到真空歧管中（見注釋 5) 。
( 5 ) 最后，用 80 μl 的洗脫液靜止孵育瓊脂糖微球 20 min，將蛋白質從瓊脂糖微球中洗脫出來，洗脫液過濾轉移到一個新鮮的 96 孔板上（見注釋 6)。
( 6 ) 蛋白質在 4°C 下保存。
( 7 ) 純化的蛋白質可被分離，如用 15% 的聚丙烯酰胺凝膠（圖 28-2)。蛋白濃度用 Bradford 蛋白質分析方法確定。
運用上述方法，我們獲得了平均濃度約為 100 μg/ml 的純化蛋白質（數據未顯示）。
3.2 構建植物蛋白質芯片
我們將 FAST 點樣片基用作構建植物蛋白質芯片的表面，進行抗體分析或蛋白磷酸化研究 ( 見第 29 章 ) 。
( 1 ) 在構建芯片之前，先將 20 μl 的純化植物蛋白和對照（見注釋 8 ) 轉移到 384 孔板上。
( 2 ) FAST 芯片片基放在 QArmy 芯片檢測系統上，此芯片檢測系統帶濕度控制器 ( 65%~70% ) 和 16 個頂端直徑為 150 μm 的鈍頭不鎊鋼，針距為 4.5 mm。我們采用 120 μm 的點深度。
( 3 ) 每個樣品上樣一次，每個點上樣量為 0.6 nL。
( 4 ) 每一次點樣后，點樣器要用雙蒸水清洗（6 s )，熱風機吹干（2 s ) ，再用 80% 的乙醇清洗（6 s ) ，再次吹干，防止交叉污染。
( 5 ) 蛋白質芯片在密閉的片基盒中，4°C 保存。
蛋白質可以不同的模板形式點樣，如 4 X 4 、8 X 8 、10 X 10 等（見注釋 9) 。同樣， 蛋白質也可以重復點樣，如 2 次 ，4 次或多次等。研究抗體和抗原之間的相互作用，建議在兩個相同的區域在水平方向上點樣 2 次（見注釋 10)。
用這個方法構建的植物蛋白質芯片可用來進行抗體分析研究，在 4°C 保存時至少能在 3 星期內提供可重復的結果。此外，這種植物蛋白質芯片還可用于蛋白激酶磷酸化的研究 [ 8，33] ，本書中已有詳細的介紹（見第 29 章 ) 。
為了檢測固定在蛋白質芯片片基上的重組植物蛋白，按照如下方法（見 28.3.3 節 1 ) 將芯片片基孵育在抗 RGS-His6 的抗體中。圖 28-3 舉例說明了一個含有從一個 cDNA 表達文庫中表達和純化獲得的 96 個擬南芥蛋白質的芯片 [33]，蛋白質以 4 X 4 模式，在兩個相同的區域，水平方向上重復點樣，所有的重組蛋白發出一個信號，顯示蛋白質表達和純化效率，同時也說明被轉移到芯片上的樣品量足以用來檢測芯片上的被測重組蛋白質（ 圖 28-3)。
3.3 蛋白芯片上的抗體篩選
1. FAST 點樣片基上的單克隆抗體篩選
( 1 ) 植物蛋白質芯片在室溫下用 2% 的 BSA/TBST 封閉處理 1 h。
( 2 ) 將小鼠抗 RGS-His6 ( 1 : 2000 稀釋）或植物特異抗體（如大鼠抗 TCP1 抗體；1 : 1000 稀釋）稀釋在封閉液中（見注釋 11)。
( 3 ) 用 TBST 沖洗 2 次，每次 10 min。
( 4 ) 將芯片片基與相應的 Cy3 標記的第二抗體（兔抗小鼠 IgG 配抗 RGS-His6 —抗；兔子抗大鼠 IgG 配抗 TCP1 抗體）室溫下孵育 1h，這些二抗以 1:800 的比例稀釋在封閉液中（見注釋 13 和注釋 14)。
( 5 ) 用 TBST 沖洗 3 次，每次 30 min ( 見注釋 15)。
( 6 ) 在掃描之前，我們用微孔板離心機甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，產品目錄號：5810R ) 或人工吹干。
( 7 ) 用 428Arrayscanner 掃描儀或 ScanArray 4000 掃描儀檢測信號。
所有抗體孵育步驟都要在蓋板下的 200 μl 孔中進行。
為了排除二抗的非特異結合，我們進行了一組平行實驗，即，將蛋白質芯片置于不含一抗的封閉液中孵育接著用相應的二抗進行孵育，包括上述的沖洗步驟。
圖 28-4 顯示了用單克隆抗 TCP1 抗體孵育一個擬南芥蛋白質芯片后的熒光圖像。96 個通過全長 cDNA 表達克隆獲得的擬南芥蛋白質吸附在 FAST 點樣片基上（4 X 4 點樣模式，在兩個相同的區域中，水平方向上重復 2 次點樣)。這張圖顯示抗 TCP1 抗體僅特異識別 TCp1 蛋白點，并且不會與其他吸附的擬南芥蛋白質發生交叉反應（ 圖 28-4)。
2. FAST 點樣片基上的多克隆抗體篩選
( 1 ) FAST 點樣片基室溫下在魚膠（10% 溶解在 TBST 中）中封閉處理 1 h。
( 2 ) 將兔血清稀釋在封閉液中（如抗 DOF11 的稀釋比例為 1 : 1000，抗 MYB6 血清的稀釋比例為 1 : 500 ) ，然后室溫下，用其孵育芯片點樣片基 1 h。
( 3 ) 用 TBST 沖洗 2 次，每次 10 min。
( 4 ) 點樣片基在室溫下用羊抗兔子 IgG-Cy3 配體繼續孵育 1 h，配體以 1 : 800 的比例稀釋在封閉液中（見注釋 13)。
( 5 ) 用 TBST 沖洗 3 次，每次 30 min。
( 6 ) 在掃描之前，我們用微孔板離心機甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，產品目錄號：5810 R ) 或人工吹干。
( 7 ) 用 428Arrayscanner 掃描儀或 ScanArray 4000 掃描儀檢測信號。所有抗體孵育步驟都要在蓋板下的 200 μl 孔中進行。
3.4 圖像分析
點的平均強度數據（扣除背景）可通過 GenePixPro 4.0 獲得；如果要做進一步的比較，強度平均值可通過計算重復的點獲得。
