試劑、試劑盒 尿素裂解溶液IPG 干膠條水化液IPG 膠條平衡液SDS 凝膠緩沖液電極緩沖液儲液丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺溶液過硫酸銨溶液瓊脂糖溶液
儀器、耗材 等電聚焦儀 IPGphor多重垂直 SDS 電泳儀
實驗步驟
3.1 第一向：在 IPG 膠條中進行等電聚焦（ IPG-IEF)
采用 IPG ( IPG-Dalt ) 的雙向電泳技術的第一向，等電聚焦（IEF) 是采用獨立的，3 mm 寬的，附著在 GelBond PAG 支持膜上的 IPG 膠條進行的。目前已有 7cm、11cm、18cm 和（或）24 cm 長的幾乎所有需要的 pH 范圍的預制 Immobiline 干膠條。例如，寬 pH 范圍的 IPG 3~10 和 IPG 3~11，中等 pH 范圍的 IPG 4~7 或 IPG 6~9 , 窄 pH 范圍的 IPG 4~5 或 IPG 4.5~5.5 ( 如 GE Healthcare，Bio- Rad，Sigma- Aldrich，Serva) 。或者也可使用實驗室自制 IPG 干膠條。關于 IPG 灌制的細節，有興趣的讀者可以參考之前發表的方法 [21] 。
在進行 IEF 之前，需要水化 IPG 干膠條，然后再將膠條置于水平等電聚焦儀的冷卻盤上 [13，22] 。最近，一種 叫做 IPGphor 的整體系統的使用簡化并加速了 IPCMEF。這種儀器的特點有：在持膠槽中水化單獨的 IPG 干膠條或在水化同時上樣，可以選擇杯上樣，使用高電壓（8000V ) 進行后續 IEF，在 IPG 干膠條放入陶瓷持膠槽后無需再對其進行操作。
當使用 pH 大于 9 的 IPG 膠條時，DTT 的消耗會導致堿性端的水平漂移。為消除漂移，在膠條的水化液中，可用二硫代羥乙基（HED) (DeStreak，GE Healthcare ) 代替 DTT 等還原劑來保持半胱氨酸中二硫鍵的穩定。除了能去除漂移外，使用 HED 使點更清晰并提髙重復性 [23] 。而且，使 用 IPGphor，可使如核糖體和核蛋白等等電點大于 10 的極端堿性蛋白的等電聚焦得到大大的簡化。
1. IPG 膠條的水化和上樣
在進行 IEF 之前，IPG 干膠條必須在水化盒或水化盤中水化至其原始厚度 0.5 mm。IPG 干膠條可用溶解有樣品的水化液進行水化（水化上樣 ) [24] 或用不含樣品的水化液進行水化，然后再用杯上樣的方法上樣。雖然水化上樣更方便，但在樣品含有高分子質量( < 100 kDa) ，極端堿性和（或）極端疏水的蛋白質時不推薦使用這種方法。這是因為這些蛋白質不易進入膠內。其原因可能是蛋白質和水化盤壁之間的疏水互作或凝膠基質孔徑的限制作用。如果樣品體積顯著地超出 IPG 膠條水化后預計達到的體積，后一種現象就特別明顯。高分子質量蛋白質更可能留在多出的水化液中而不是進入 IEF 膠中。交叉污染也是一個問題，因此水化盤在不同次實驗之間必須徹底清洗。總之，水化上樣不如杯上樣可靠，特別是在定量實驗中。
在杯上樣中，IPG 干膠條仍舊用水化液水化。IPG 膠條水化后，將溶解在裂解緩沖液中的樣品（20~100 μl ) 加 入在 IPG 膠條表面上的一次性塑料或硅膠杯中（見注釋 3)。將樣品加在 pH 極端位置時效果最好，也就是靠近陰極或陽極。大多數情況下在陽極附近上樣比在陰極附近上樣更好。當使用堿性 pH 梯度，如 IPG 6~12 或 9~12，所有樣品都必須從陽極上樣 [15~17] 。
單根 IPG 膠條的蛋白質上樣量由幾個因素決定。按照經驗：分離距離越長（也就是膠條越長），pH 梯度范圍越窄，蛋白質檢測方法越不靈敏，則所需蛋白質越多。20 cm X 20 cm 的分析用（銀染）雙向電泳凝膠的推薦上樣量為 50~100 μg，微量制備凝膠的推薦上樣量多至 1 mg ( 或更多）。當使用非常窄的 pH 范圍的 IPG 膠條時，我們強烈建議僅使用預分離后的樣品 [ 25 ] 。
1 ) 用水化盤水化 IPG 干膠條
( 1 ) 如果在水化的同時上樣 [24]，則直接將細胞裂解產物或組織樣品（5~10 mg 蛋白質/ml ) 溶解至適量的 IPG 干膠條水化液中。水化 180 mm 長、3 mm 寬的膠條時，可吸取 350 μl 上述溶液置于 IPG 干膠條水化盤中的凹槽中（圖 13-2)。如 IPG 膠條更長或更短，水化液體積需要進行相應換算（如 240 mm 長的 IPG 干膠條用 450 μl) 。
( 2 ) 從 IPG 干膠條表面撕去保護膜，將 IPG 膠條膠面朝下放入凹槽中，同時避免產生氣泡。然后用 IPG 干膠條覆蓋油覆蓋 IPG 膠條（避免水化時膠條變干）。覆蓋前膠條應能夠活動且沒有粘在水化盤上。覆蓋后在約 20°C 條件下過夜水化 IPG 膠條。溫度過高（ > 37°C ) 有氨基甲酰化的危險，而溫度過低（< 15°C ) 會導致尿素在 IPG 膠中結晶。
( 3 ) 如果使用杯上樣，則將 IPG 干膠條用沒有樣品的水化液在水化盤中仍舊按上述第二步的方法過夜水化。
2 ) 用 IPGphor 持膠槽水化膠條并同時上樣
( 1 ) 用樣品溶解緩沖液（也就是尿素/硫脲裂解緩沖液）溶解蛋白質并用 IPG 干膠條水化緩沖液稀釋提取液。
( 2 ) 將所需數量的 IPGphor 持膠槽（圖 13-2) 置于 IPGphor 的冷卻盤/電極區域。
( 3 ) 吸取 350 μl 溶有樣品的水化液（使用 180 mm 長 的 IPG 膠條時）放入持膠槽底部。
( 4 ) 由 IPG 膠條上去除保護膜，然后緩慢地將 IPG 膠條（膠面朝下）放入水化液中。避免產生氣泡。膠條應仍然能夠活動且沒有粘在水化盤上。用 1~2 ml IPG 干膠條覆蓋油覆蓋 IPG 膠條然后蓋上塑料蓋。按壓在蓋子下的支撐塊以確保 IPG 膠條在水化時與電極保持良好接觸。水化時加低電壓（30~50 V ) 以使高分子質量蛋白質更好地進入膠內 [15，28] 。