3. 糖基釋放后的蛋白質分析
1 ) 糖基釋放的化學處理方法
還原性氨化反可應選擇性的解離糖蛋白上的 O-糖苷（見注釋 10) 。去糖基化的蛋白用 1D SDS-PAGE 分析，將其遷移情況與其糖基化形式的蛋白進行比較，電泳遷移率的增加是 O-連糖苷出現在蛋白上的證據（見注釋 11)。
( 1 ) 將 1 mg 純化的蛋白樣品放入帶聚四氟乙烯涂層的螺旋蓋子的玻璃管中，進行凍干處理。
( 2 ) 將干燥樣品溶解于 500 μl 硼氫化鈉溶液中，蓋緊玻璃管，37°C 過夜放置。
( 3 ) 逐滴添加乙酸來終止還原性氨化反應，直至無氣體產生。再加入 500 μl 的 10% 乙酸甲醇溶液。在通風櫥內風干。重復洗滌過程 3 次以洗去剩余的硼酸鹽。
( 4 ) 去糖基化處理后，去糖基化蛋白用 4 倍體積的乙醇于 -20°C 過夜沉淀處理，用合適的緩沖液溶解沉淀物用于 1D SDS-PAGE。同時可回收乙醇相中的糖苷，用于單糖組分分析（見 25. 3.2 節 2) 。
2) N-或 O-糖苷酶的酶促處理
用糖苷酶處理純化獲得的糖蛋白可得到進一步的信息。內切糖苷酶 H ( Endo H ) 只能通過水解 N-糖苷中心的兩個 GlcNAc 殘基之間的糖苷鍵，來解離植物糖蛋白中的高甘露糖型的 N-糖苷（圖 25-3)。多肽 N-糖苷酶（ PNGase) 通過水解位于肽鏈骨架天冬酰胺和寡聚糖近端 GlcNAc 之間的鍵，解離高甘露糖 N-糖苷和復合 N-糖苷。PNGaseF，一種被廣泛應用于哺乳動物糖蛋白分析的 N-糖苷酶，可解離高甘露糖 N- 糖苷和復合 N-糖苷，但不能水解與鄰近 GlcNAc 連接的 α-1-3-巖藻糖殘基。PNGaseA 可解離所有類型的植物糖苷（圖 25-3)，但它幾乎只對糖肽起作用，所以需要在去糖基化之前酶解糖蛋白 [23，24] 。糖蛋白或肽的去糖基化分析方法有：①電泳遷移的增加；② Endo H 或 PNGaseF 處理后，糖蛋白對糖苷特異性探針免疫活性的喪失；③ EndoH、 PNGase F 或 PNGase A 處理后的質譜分析。對于 O-糖苷酶可以采用同樣的手段和方法，但是我們實驗室很少用，因此不在此詳述（詳情見參考文獻 25 和 26)。
內切糖苷酶 H 去糖基化。
( 1 ) 在用 EndoH 去糖基化酶促處理之前，將純化獲得的蛋白質在 1% SDS ( m/V）存在下，100°C 加熱變性處理 5 min。
( 2 ) 用 150 mmol/L 乙酸鈉溶液（pH 5.7 ) 將樣品稀釋 5 倍，加入 10 mU 的 Endo H，將混合液在 37°C 溫育 6 h。
( 3 ) 如果酶切后要進行電泳、親和反應或者免疫檢測，那么，要在去糖基化反應后，加入等體積的兩倍濃度的電泳樣品緩沖液（見 25.3. 2 節 1) ，酶切處理后的樣品也可脫鹽處理，用于質譜分析。
肽 N-糖苷酶 F去糖基化：
( 1 ) 用 含 0.1% SDS 的 0.1 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 ) 消化處理待酶切的蛋白樣品。
( 2 ) 樣品在 100℃ 加熱 5 min，將蛋白質變性。室溫下降溫，然后加入含 0.5% Nonidet P-40 的等體積的 0.1 mmol/L Tris- HCl，pH 7.5 ( 見注釋 12)。
( 3 ) 用肽 N-糖苷酶 F 37°C 溫育樣品 24 h ( 1 U 酶/100 μg 蛋白用）。
( 4 ) 酶解消化后，用 4 倍體積的乙醇在 -20°C，過夜沉淀去糖基化蛋白質。
( 5 ) 離心樣品。回收沉淀中的去糖基化蛋白，并將其溶解在適當的緩沖液中，供凝膠電泳和質譜分析。
肽 N-糖苷酶 A 去糖基化：
( 1 ) 將 100 μg 蛋白質樣品溶解在 500 μl 的 10 mmol/L HCl ( pH 2.2 ) 中，加入 10 μg 胃蛋白酶，37°C 消化 24 h，再次加入同樣量的胃蛋白酶，繼續消化 24h。100°C 加熱 5 min 終止反應。
( 2 ) 冷卻樣品，然后取 10% 的溶液用 C18 色譜柱純化肽和糖肽混合物。
( 3 ) 用 5 mL 乙腈沖洗 C18 層析柱，再用 5 mL 水沖洗 C18 層析柱。用蒸餾水將稀釋的樣品定容至終容積為 1 ml，加樣到 C18 層析柱。用 5 mL 水沖洗柱子去除樣品中的鹽分，用 5 ml 乙腈洗脫結合到柱子上的肽。吹干乙腈濃縮肽樣品。用 MALDI-TOF 質譜檢測肽和糖肽的分子質量，這樣可在內切糖苷酶 A 處理之前，獲得糖肽的質量數據。
( 4 ) 將剩余的樣品冷凍干燥，溶解在 500 μl 的 100 mmol/L 乙酸鈉溶液（pH 5.5 ) 中。
( 5 ) 將樣品用 0.1 mU 肽 N-糖苷酶 A 在 37°C 消化 18 h。然后冷凍干燥樣 品，用 C18 色譜柱，按照步驟（2 ) 和 步驟（3 ) 的操作，將肽與寡聚糖分開。通過 MALDI-TOF 質譜分析去糖基化肽，比較去糖基化處理前后得到的兩種譜型，得到一些由于 N- 糖苷的去除引起的離子質量差異，結合去糖基化過程中所使用的酶和植物糖蛋白的信息，來判斷蛋白質上 N-糖苷的種類和結構形式。
這個實驗所需要的試劑都包含在檢測試劑盒中，商品酶促去糖基化試劑盒由 Prozyme 公司生產。需要說明的是，按廠家說明使用該試劑盒。實驗者可以獲得有關被測糖蛋白上的糖苷類型（N - 和 O- 連接）的信息。