1. 含高甘露糖型 N-糖苷糖蛋白的鑒定
本方法是我們實驗室以油菜籽為實驗材料建立的，本方法也適用于其他植物材料。
( 1 ) 將 6 g 植物材料放入 4°C 預冷的研缽中，加入 50 ml 預冷的 TBS 緩沖液，研磨萃取蛋白質（見注釋 13)，接著 10000 g 離心萃取物 30 min，去掉不溶物，然后 150000 g 離心 1 h，沉淀膜碎片。用 Bradford 蛋白檢測方法測定上清液中的可溶性蛋白濃度。將樣品分裝成每份含 20 mg 蛋白質，冷凍存備用。
( 2 ) 4°C 解凍一份 20 mg 的樣品，10000 g 離心 30 min，0.20 μm 過濾膜過濾去除所有的不溶物。加入冷 TBS 緩沖液定容至 35 ml，加入 CaCl2 和 MgCl2 至終濃度為 1 mmol/L。
( 3 ) 將相當于 1 ml 刀豆蛋白 A-瓊脂糖樹脂重懸在 50 ml TBS 緩沖液中，用 50 ml 的 TBS 緩沖液沖洗樹脂 2 次 ，每次沖洗后通過沉降或者離心（3500 g，10 min) 回收樹脂。
( 4 ) 洗漆后的樹脂與 35 ml 樣品于 4°C，在旋轉振蕩器上振蕩 2 h。將樹脂倒入 PolyPrep 柱子中，沖洗去除未結合在柱子上的蛋白質。
( 5 ) 先用 50 ml TBS 緩沖液沖洗樹脂 5 次，再用 50 ml TBS 緩沖液沖洗樹脂 5 次，然后如步驟（3 ) 所述方法，用 50 ml TBS 緩沖液重懸樹脂。
( 6 ) 將樹脂倒入 Poly- Prep 柱子中，去除殘余的 TBS 緩沖液，用 10 ml 含 0.3 mol/L α-甲基甘露糖 TBS 緩沖液重懸柱子中的樹脂。置于 4°C 旋轉振蕩 1 h ( 見注釋 14)。
( 7 ) 用 15 倍體積的含 0.3 mol/L α-甲基甘露糖的 TBS 緩沖液洗脫糖蛋白，用同樣的溶液沖洗樹脂，混合這兩部分樣品，最終的混合物就是純化的連接高甘露糖型 N-糖苷的糖蛋白。
( 8 ) 用 Bradford 蛋白檢測方法確定蛋白濃度，在 12.5% 三氯乙酸（最終濃度）中，4°C 過夜沉淀糖蛋白樣品。10000 g 離心 15 min 沉淀蛋白，用丙酮/水 [ 9 : 1 ( V/V )] 溶液沖洗沉淀，再次離心。重復洗滌過程兩次，將蛋白質溶解在適當的樣品緩沖液中供 2D 電泳分析用。
( 9 ) 用 2D 凝膠分離糖蛋白，蛋白點通過膠態藍染色。分別收集每個可視的點（見注釋 15)。胰蛋白酶酶解收集到的蛋白點。用 LC-MS/MS 分析酶消化產物。提交獲得的肽段序列信息到 NCBI 非冗余數據庫在可選擇的物種限制范圍內，進行 “短的、幾乎準確的匹配” blast 檢索（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。
一經鑒定，糖蛋白應進行以下兩點鑒別：① 它們是被分泌出來的，或其有一個潛在的信號肽嗎？② 它們至少擁有一個潛在的 N-糖基化位點嗎？一個蛋白質中的糖基化位點可通過與 Prosite 數據庫（http : //npsa- pbil. ibcp . fr /cgibin / npsa _ autom at, p i ? page = npsa _ prosite , html 或 http：// www . expasy . org /tools /scanprosite / ) 比對確定。
2. O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白的鑒定
鑒定 O-GlcNAc 糖蛋白質組需要麥胚凝集素（WGA) 親和層析的糖蛋白純化。之前的實驗表明 WGA 既可以結合 O-GlcNAc 糖蛋白也可以結合帶 N-糖苷的蛋白質[ 28] 。所以必須預先去除 N-糖苷，才能用親和層析柱選擇性地純化 O 位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白。這個去糖基化過程可通過能去除高甘露糖型和復合型 N-糖苷的肽 N-糖苷酶 F 來實現。但是如前所述，由于與鄰近 N-糖苷中心 GlcNAc 連接的 α-1-3 巖藻糖的存在，肽 N-糖苷酶 F 對植物復合型糖苷的作用很有限 [ 見 25. 3. 2 節 3. 2 ]。為了克服這個不利因素，要讓植物材料保持對 PNGaseF 敏感的高甘露糖型糖苷形式。本實驗方法是我們實驗室開發的用于將突變體的細胞培養物的 N-糖苷轉變為 Man5GlcNAc2 結構 [29] 。這個實驗方法應該適用于其他的植物材料，實現高甘露糖型 N-糖苷的糖基化。
( 1 ) 用神奇濾布過濾 150 ml 細胞培養物，然后將細胞培養物懸浮在 150 ml 0.5 mol/L NaCl 溶液中，4°C 攪拌 30 min 溶解以離子鍵結合細胞壁上的蛋白質（見注釋 16 和注釋 17)。
( 2 ) 用神奇濾布再次過濾細胞培養物。棄上清，在含 150 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT 和蛋白酶抑制劑的 30 ml 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8 ( WGA 緩沖液）中研磨細胞培養物。
( 3 ) 4°C 下萃取物經 5500 g 離心 15 min，接著 25000 g 離心 30 min 后，棄去不溶物，分裝到 5 ml 管中。
( 4 ) 用 Centricon 離心超濾管（Amicon Bioseparation YM-10 ) 將 5 ml 的組分濃縮到 0.5 ml。
( 5 ) 濃縮后，加 SDS 到樣品中使其含有 0.1% SDS，100°C 加熱 5 min 變性處理糖蛋白。再加入 NonidetP40 使其終濃度為 0.5% ( 見注釋 12)。蛋白質處理變性后，加入 PNGaseF ( 5 U )，37°C 攪動溫育 24 h 進行蛋白質去糖基化反應。這一步驟中，只有 N-糖苷被消除掉。
( 6 ) 用 WGA 緩沖液將去糖基化樣品稀釋 20 倍，將其與 100 μl WGA-瓊脂糖混合，4°C 旋轉振蕩 4 h。用柱體積 20 倍的 WGA 緩沖液沖洗樹脂去除未結合在柱子上的蛋白質。
( 7 ) 為了洗脫結合在柱子上的蛋白質，將樹脂與 5~10 倍體積的含 0.5 mol/L GlcNAc 的 WGA 緩沖液在 4°C 混 合 30 min ( 見注釋 18)。收集洗脫液， 重復相同的洗脫處理一次。合并這兩次洗脫液，這個糖蛋白組分只含有 O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白質。
( 8 ) 加入三氯乙酸達到終濃度為 12.5%，4°C 過夜沉淀糖蛋白。10000 g 離心 15 min 沉淀蛋白質，用丙酮/水 [ 9 : 1 ( V/V ) ] 溶液洗滌蛋白沉淀 3 次，將蛋白質沉淀物懸浮在一種適當的緩沖液中供 1D 電泳備用。
( 9 ) 用 1D SDS-PAGE 凝膠電泳分離 O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白質。經考馬斯亮藍染色后，收集膠內的所有可見條帶，經胰蛋白酶消化后，用 MALDI-TOF 或 LCMS/MS 鑒定蛋白質。
3.5 結論與展望
應用本章所列的實驗方法可獲得一個植物糖蛋白的糖苷及其組成單元、連接方式的功能。事實上，相同的寡糖序列連接到不同的糖蛋白上，或出現在植物體內不同的位置，亦或出現在植物生活周期的不同時間，都可能表現出不同的功能。因此，新興的糖蛋白質組學研究正，為了解 N-糖苷和 O-糖苷的作用，開劈一條新的途徑。縮短這一領域的差距將拓展我們對于植物生理學的認識，也為生物化學和醫學提供了更加廣闊的前景。